加味柴胡疏肝汤君臣配伍抗癫痫作用机制的网络药理学和分子对接研究∗
时间：2023-04-08 15:40:03 来源：千叶帆 本文已影响人
卢 玲，胡跃强，廖现秋，李 欢，蔡 伦，刁丽梅△
1 广西中医药大学，广西 南宁 530001；
2 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530000
癫痫是一种严重的神经系统疾病［1］，伴有多种并发症。它反复发作，严重影响患者的工作和生活质量。加味柴胡疏肝汤具有疏肝理气、调畅气机的功效，其君药（柴胡）、臣药（香附、川芎）皆属肝经，临床上常辨证用于治疗癫痫［2］。前期临床实践及基础研究已证实加味柴胡疏肝汤具有抗癫痫作用［3-4］，但是加味柴胡疏肝汤中君臣配伍的抗癫痫作用机制尚未明确。因此，本研究通过网络药理学技术和分子对接技术初步揭示加味柴胡疏肝汤君臣配伍抗癫痫的作用机制。
1.1 癫痫相关靶标的筛选分别在DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）和Gene-Cards数据库（https://www.genecards.org/）数据库中查询得到癫痫相关的靶标。并通过Venny在线软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对这两个数据库分别预测到的癫痫靶标取交集，得到与癫痫相关的靶标。
1.2 加味柴胡疏肝汤中君药和臣药的有效成分及靶标收集在TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中检索得到加味柴胡疏肝汤中君药（柴胡）和臣药（香附、川芎）的所有成分及作用的靶标。根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18进行过滤。同时通过文献挖掘补充不在筛选范围，但已有相关实验或临床研究证实具有抗癫痫作用的有效成分。
1.3 加味柴胡疏肝汤君臣配伍抗癫痫作用的潜在靶标将癫痫相关的靶标与加味柴胡疏肝汤君臣配伍作用的靶标导入在线软件Venny进行映射，得到加味柴胡疏肝汤君臣配伍抗癫痫作用的潜在靶标。
1.4 基因功能关联网络的构建STRING数据库（https://string-db.org/）可用于分析潜在靶标基因之间的相互作用关系。将潜在靶标导入STRING数据库中构建基因功能关联网络，再将结果导入Cytoscape 3.6.1软件进行可视化，并计算网络中的节点连接度（degree值）。
1.5 靶标基因功能富集分析使用R语言软件（版本：v.3.5.0）中clusterProfiler包对潜在靶标进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析、基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。以P＜0.05为标准选取符合条件的前15个GO生物功能和KEGG信号通路。
1.6 构建关键“成分-靶标-通路”关系网络对加味柴胡疏肝汤君臣配伍的有效成分、潜在靶标、富集的前15个KEGG信号通路进行数据编排，导入Cytoscape 3.6.1软件进行可视化，构建“加味柴胡疏肝汤君臣配伍有效成分-抗癫痫潜在靶标-KEGG通路”多维关系网络。计算网络中的degree值，筛选出网络中连接度最大的前3个核心靶标，用于分子对接预测。
1.7 分子对接在PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查询加味柴胡疏肝汤君臣配伍有效成分的化学式及2D、3D结构信息。从UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）中收集癫痫相关的核心靶标蛋白的3D结构信息，并通过Autodock Vina实现加味柴胡疏肝汤君臣配伍有效成分与癫痫核心靶标的分子对接，用于判断靶标蛋白与药物有效成分的结合性。
2.1 癫痫相关靶标的筛选从DisGeNET数据库中预测得到癫痫相关的靶标有1176个，Gene-Cards数据库中癫痫相关的靶标有5064个。两者取交集，得到1074个癫痫相关的靶标。见图1。
图1 两个数据库中癫痫相关的1074个靶标
2.2 加味柴胡疏肝汤抗癫痫作用的潜在靶标通过在线软件Venny对癫痫相关的1074个靶标和加味柴胡疏肝汤君臣配伍有效成分作用的204个靶标进行映射。得到加味柴胡疏肝汤君臣配伍抗癫痫的潜在靶标共37个。见图2。
图2 抗癫痫潜在靶标韦恩图
2.3 加味柴胡疏肝汤君臣配伍的有效成分及靶标加味柴胡疏肝汤中君臣配伍的成分共有642种，包括柴胡349种、香附104种、川芎189种。根据筛选标准去重后，得到加味柴胡疏肝汤君臣配伍的有效成分35种，其共作用于204个靶标，结果表明：君药和臣药中可含有同一种有效成分。见表1。
表1 加味柴胡疏肝汤君臣配伍的有效成分基本信息
2.4 基因功能关联网络的构建将加味柴胡疏肝汤君臣配伍的37个潜在靶标导入STRING数据库，构建基因功能关联网络，并计算网络中的节点连接度。结果表明除了靶标CHRNA2外，其余靶标基因之间均有直接或间接的相互作用关系，见图3。图中颜色由黄色变红色，图形由小变大，代表节点的degree值增加；
线条由细变粗代表节点的结合分数变大；
由此筛选出排名前10的靶标基因，包括：AKT1、ESR1、IL-6、FOS、EGF、APP、IL-1B、MAPK1、CCL2、GJA1。
图3 靶标基因功能关联网络
2.5 基因功能富集分析使用clusterProfiler包对37个抗癫痫潜在靶标进行基因功能富集分析，结果表明：抗癫痫的潜在靶标共富集了69个GO生物学功能，其中根据P值由小到大排名前15的包括神经递质受体的活动、生长因子受体结合、通道活性、被动跨膜转运蛋白活性、氧化还原酶活性、类固醇羟化酶活性、细胞因子活性、配体门控离子通道活性、配体门控通道活性、受体激活活性、血小板衍生生长因子结合、发射门控离子通道活性、发射门控通道活性、细胞因子受体结合、氧化还原酶活性，见图4。此外，潜在靶标还涉及了113条KEGG信号通路，排名前15的为：糖尿病并发症的年龄-愤怒信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、雌激素信号通路、南美锥虫病（美洲锥虫病）、朊病毒病、鼠疫感染、结核病、百日咳、风疹、C型凝集素受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、移植物抗宿主病、结肠直肠癌、缝隙连接。见图5。
图4 GO分析柱状图
图5 KEGG分析气泡图
2.6 构建“成分-靶标-通路”多维关系网络把加味柴胡疏肝汤君臣配伍的有效成分、潜在靶标以及富集的前15条KEGG信号通路进行编排，导入Cytoscape软件，构建得到“加味柴胡疏肝汤君臣配伍有效成分-抗癫痫潜在靶标-KEGG通路”多维关系网络，见图6。计算网络中的degree值，筛选出排名前3的核心靶标AKT1、MAPK1、IL-6用于分子对接预测。结果表明：加味柴胡疏肝汤君臣配伍通过多成分、多靶标、多途径发挥抗癫痫作用。AKT1、MAPK1和IL-6这3个核心靶标不仅在“成分-靶标-通路”网络中发挥着重要的作用，它们也是基因功能关联网络中degree值排名前10的靶标基因，也在该网络中发挥着重要的作用。见表2。
表2 君臣配伍有效成分与核心靶标分子对接基本信息
图6 加味柴胡疏肝汤君臣配伍有效成分-抗癫痫潜在靶标-KEGG通路关系网络
2.7 分子对接结果为验证各有效成分与靶标之间的结合性强弱，将筛选出的3个核心靶标蛋白AKT1、MAPK1和IL-6分别与加味柴胡疏肝汤君臣配伍的有效成分小分子进行两两对接，见表2。当亲合能＜-5.0 kJ/mol时，表明其结合性良好，结合能越小则分子间对接越好。结果表明：加味柴胡疏肝汤君臣配伍的抗癫痫有效成分均与核心靶标具有良好的结合性。加味柴胡疏肝汤君臣配伍对癫痫的疗效可能是多靶标共同作用的结果，并且与君臣配伍有效成分和癫痫靶标的良好结合性密切相关。
中药君臣配伍在方剂治疗疾病中发挥着重要的作用［5］。加味柴胡疏肝汤善于疏肝解郁，化痰熄风，是“从肝论治”治疗癫痫的代表方剂之一。方中柴胡为君药，具有疏肝解郁之效；
香附疏肝理气，川芎活血行气，二药相合，可助柴胡解肝经之郁滞，并增行气活血之效，共为臣药［3］。研究证实，柴胡中柴胡皂苷、川芎中川芎嗪均有抗惊厥作用［6］；
香附的黄酮类成分能作用于中枢神经系统，具有抗氧化作用［7］。本研究通过网络药理学技术筛选出加味柴胡疏肝汤君药、臣药的有效成分，发现君药和臣药中可含有同一种有效成分。且在关系网络中君臣共有的有效成分其节点连接度均大于单味药物的有效成分。因此，加味柴胡疏肝汤君臣配伍发挥着重要的抗癫痫作用。
本研究筛选的AKT1、MAPK1和IL-6这3个核心靶标不仅在“成分-靶标-通路”关系网络中发挥着重要的作用，也在基因功能关联网络中扮演着重要的角色。PI3K/mTOR通路的激活和表达常见于多种神经系统疾病中，如癫痫等。AKT又称蛋白激酶B-PKB，是一种由氧化应激激活的丝氨酸/苏氨酸激酶，它是PI3K/mTOR通路最重要的下游效应因子之一，与癫痫的发生密切相关［8］。而AKT的异构体AKT1也被证实在癫痫的治疗中起着重要的作用［9］。研究认为，神经炎症在癫痫发病机制中起着重要作用，而与炎症反应相关的细胞因子的水平也被证实在癫痫发作时明显升高［10］。此外，癫痫持续状态后常出现星形胶质细胞自噬，而丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）可介导星形胶质细胞自噬［11］。综上，本研究筛选的核心靶点AKT1、MAPK1和IL-6均与癫痫密切相关，且可能参与到炎症反应、氧化应激等过程中。
基因富集分析的结果表明，潜在靶标主要影响了神经递质受体的活动、生长因子受体结合、通道活性、氧化还原酶活性、细胞因子活性、受体激活活性、血小板衍生生长因子结合、细胞因子受体结合等69个GO生物学功能，这些生物学功能大部分均与癫痫的炎症反应、氧化应激等生物学变化有关［12］。潜在靶标涉及的前15条KEGG信号通路中，与癫痫的病理生理过程密切相关的主要有：雌激素信号通路、C型凝集素受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等。雌激素具有高度亲脂的性质，能够通过血脑屏障到达神经元组织，从而影响癫痫损伤的神经元区域。实验研究证实，在动物体内应用雌激素可上调生存分子Bcl-2，发挥抗氧化潜能，保护神经肽-Y中间神经元，从而较少癫痫发作引起的神经元死亡［13］。雌二醇被证实可以通过抗炎和神经保护作用来抑制中枢神经系统自身免疫和炎症［14］。C型凝集素受体能够与坏死细胞释放的组蛋白结合，从而导致炎症和组织损伤［15］。肿瘤坏死因子α介导的炎症在急性癫痫的发生发展中起重要作用，它可以通过肿瘤坏死因子受1调节谷氨酸受体的运输，从而促进兴奋性突触传递增加［16］。此外，EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药也在炎症反应中扮演着重要的角色［17］。
本研究结果表明，君臣配伍有效成分均与核心靶标结合性良好。并基于网络药理学和分子对接技术初步阐明了加味柴胡疏肝汤君臣配伍的抗癫痫作用机制，进一步揭示中药复方的组方规律和疗效。为加味柴胡疏肝汤在抗癫痫方面的临床应用奠定了良好的理论基础，也为本课题组后期的实验研究打下了基础。
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