高压液相色谱法同时测定泌感合剂中6种黄酮类成分研究
时间：2023-02-04 11:45:11 来源：千叶帆 本文已影响人
彭敏 符映均 童晓东 姜晓燕 杨水英 刘忠美 倪红辉 张硕
摘要 目的：建立高压液相色谱法（HPLC）同时分析并测定泌感合剂中落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素的含量。方法：采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）;流动相：甲醇（A）-0.4%磷酸水（B），梯度洗脱;检测波长320 nm;流速1.0 mL/min;柱温23 ℃。结果：落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素分别在0.144～1.44 μg（r=0.999 9）、0.196～1.96 μg（r=0.999 7）、0.076～0.76 μg（r=0.999 3）、0.034～0.34 μg（r=0.999 3）、0.032～0.32 μg（r=0.999 8）、0.026～0.26 μg（r=0.999 5）范围内进样量与峰面积线性关系良好;平均回收率在分别为95.6%、96.3%、94.5%、92.3%、97.8%、95.2%;相对标准偏差（RSD）分别为1.7%、1.5%、2.2%、1.2%、2.0%、1.6%。结论：该方法操作简单、稳定、可重复，可用于同时分析测定泌感合剂中6种黄酮类成分的含量。
关键词 泌感合剂;落新妇苷;野黄芩苷;野黄芩素;木犀草素;芹菜素;异鼠李素;高压液相色谱法;含量测定
Simultaneous Determination of Six Flavonoids in Migan Mixture by HPLC
PENG Min，FU Yingjun，TONG Xiaodong，JIANG Xiaoyan，YANG Shuiying，LIU Zhongmei，NI Honghui，ZHANG Shuo
（Nantong Hospital of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu Province，Nantong 226000，China）
Abstract Objective：To develop a method for simultaneous determination of astilbin，scutellarin，scutellarein，luteolin，apigenin，and isorhamnetin in Migan Mixture by high-performance liquid chromatography（HPLC）.Methods：Separation was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm） at 23 ℃.The mobile phases were methanol（A）-0.4% phosphoric acid（B） with gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1 and the detection wavelength was 320 nm.Results：Astilbin，scutellarin，scutellarein，luteolin，apigenin，and isorhamnetin showed good linearity between the injection volume and the peak area at 0.144～1.44 μg（r=0.999 9），0.196～1.96 μg（r=0.999 7），0.076～0.76 μg（r=0.999 3），0.034～0.34 μg（r=0.999 3），0.032～0.32 μg（r=0.999 8），and 0.026～0.26 μg（r=0.999 5），respectively.The average recoveries were 95.6%，96.3%，94.5%，92.3%，97.8%，and 95.2%，with RSDs of 1.7%，1.5%，2.2%，1.2%，2.0%，and 1.6%，respectively.Conclusion：This method is simple，stable，and repeatable，which can be used to determine the content of six flavonoids in Migan Mixture by HPLC.
Keywords Migan Mixture; Astilbin; Scutellarin; Scutellarein; Luteolin; Apigenin; Isorhamnetin; High-performance liquid chromatography; Simultaneous determination
中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.10.004
泌感合剂是由白花蛇舌草、金钱草、半枝莲、地榆、土茯苓、炒知母等八味药材制备而成的中药合剂，属于南通市中医院自制制剂。用于治疗湿热引起的淋症、带下，对肾盂肾炎、尿道炎引起的尿急、尿频、尿痛，宫颈炎引起的阴道刺痒、带下有较好的治疗作用[1]。
研究发现，黄酮类物质是泌感合剂的主要药效物质[2]，其中野黄芩苷[3]、落新妇苷[4]、木犀草素[5-6]、野黄芩素[7]等均具有抗炎、抗氧化作用。2015版《中华人民共和国药典》中，野黄芩苷、落新妇苷分别是半枝莲、土茯苓的指标性成分[8];研究表明，野黄芩素、木樨草素、芹菜素、异鼠李素也是半枝莲黄酮成分的特征组成[9-10]。
本课题前期测定了总黄酮及其代表物质山柰素、槲皮素的含量[2，11]，但这并不足以反应制剂的质量，现结合黄酮类有效组分研究与《中华人民共和国药典》含量测定方法，同时测定落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素的含量，以期从多成分、协同作用的角度，更好地控制产品质量。
1 仪器与试药
1.1 仪器 高效液相色谱仪（配DAD检测器，赛默飞世尔科技有限公司，美国，型号：DIONEX-UltiMate 3000）;分析天平（梅特勒-托利多有限公司，瑞士，型號：MS105D）。
1.2 试剂 对照品落新妇苷（批号：111798-201504）、野黄芩苷（批号110842-201709）、木犀草素（批号：111520-201605）、芹菜素（批号：111901-201603），购自中国食品药品检定研究院;异鼠李素（批号：YZ093020）、野黄芩素（批号：YZ094015），购自南京源植生物科技有限公司。水为超纯水;甲醇为色谱纯;乙酸乙酯、磷酸等均为分析纯。
1.3 分析样品 泌感合剂为本院制剂（批号：20171023、20180413、20180821）;药材金钱草（批号：170830）、白花蛇舌草（批号：180602）、半枝莲（批号：180731）、川牛膝（批号：170518）、土茯苓（批号：180912）、地榆（批号：180304）、炒知母（批号：181114）、炒黄柏（批号：180613），均购自南通三越中药饮片有限公司。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为甲醇（A）-0.4%磷酸水（B），洗脱梯度（0～25 min，29%A;26～35 min，36%A;36～42 min，38%A;43～66 min，48%A;67～78 min，53%A）流速为1 mL/min，进样量10 μL;柱温：23 ℃，检测波长320 nm。
2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素标准品0.72 mg、0.98 mg、0.38 mg、0.17 mg、0.16 mg、0.13 mg，置于容量瓶中，加70%甲醇定容至20 mL。
2.3 供试品溶液的制备 精密量取泌感合剂20 mL，加入浓盐酸0.3 mL，100 ℃水浴回流1 h，静置至室温，用乙酸乙酯萃取3次，每次50 mL[2]。取乙酸乙酯层，合并萃取液，倒入蒸发皿中水浴蒸干，冷却后用70%甲醇溶液定容至20 mL容量瓶中。
2.4 阴性对照溶液的制备 按泌感合剂处方工艺，照“2.3”项下的方法分别制备缺土茯苓、缺半枝莲的阴性对照溶液。
2.5 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件分别进样测定。结果各成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数以各色谱峰均大于3 000，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。见图1。
2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液4 μL、8 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL，按照“2.1”项下的色谱条件，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性方程。见表1。
2.7 精密度试验 精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液10 μL，按照“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，记录峰面积并分别计算相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。结果落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素的RSD分别为0.17%、0.16%、1.4%、0.56%、0.53%、0.29%，表明仪器精密度良好。
2.8 稳定性试验 精密量取泌感合剂（批号：20180821）20 mL，按照“2.3”项下的方法，制备成供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件，于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h分别进样，并记录峰面积值。计算得落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素峰面积的RSD分别为1.76%、0.62%、1.55%、1.24%、1.84%、1.27%，表明泌感合剂在室温下24 h内稳定性良好。
2.9 重复性试验 精密量取泌感合剂（批号：20180821）6份，每份20 mL，按“2.3”项下的方法制备成供试品溶液，以“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积并计算RSD值。结果落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素含量的RSD分别为1.63%、1.22%、1.68%、1.49%、0.88%、1.54%，表明该方法重复性良好。
2.10 回收率试验 精密量取6份已知含量的泌感合剂（批号：20180821，落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素含量依次为0.040 8、0.116 4、0.040 2、0.005 6、0.014 9、0.010 2 mg/mL），每份10 mL，加入适量对照品，按照“2.3”项下的方法制备成加样供试品溶液，并以“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积，并分别计算含量及加样回收率。见表2。
2.11 样品测定结果 取泌感合剂三批（批号：20171023、20180413、20180821），每批2份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并以“2.1”项下的色谱条件进样测定，每批样品平行测3次。计算每批样品中落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素的平均含量。见表3。
3 讨论
泌感合剂具有良好的清热解毒功效，这种功效可能主要来源于其中半枝莲、土茯苓、白花蛇舌草、金钱草等所含的黄酮类成分[12-15]。本研究在原有制剂标准的基础上对这类成分进一步分析，除了槲皮素与山柰素外[2]，泌感合剂还含有绿原酸、咖啡酸、花旗松素、芹菜素、落新妇苷、野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素、异鼠李素等组分。尽管其中绿原酸、咖啡酸、花旗松素具有显著的抗炎、抗菌、抗氧化作用[16-18]，但是在既定色谱条件下，绿原酸、咖啡酸专属性较差，花旗松素分离度较差，均无法用于含量测定。
本实验研究的6种黄酮类成分吸收波长差异较大，落新妇苷在292 nm有最大吸收[19]，野黄芩苷、野黄芩素、芹菜素在330 nm有最大吸收[20]，木犀草素、异鼠李素在360 nm有最大吸收[21]。考虑落新妇苷的分离度、各个目标成分的峰型对称性、阴性干扰及基线的平稳程度，分别比较了泌感合剂梯度洗脱过程中不同时段在290 nm、300 nm、320 nm、360 nm的色谱行为，最终选择320 nm为整个梯度洗脱过程的检测波长。尽管单一波长检测能够兼顾6种成分，但是多波长检测可能灵敏度、专属性更高。
在高效液相色谱中，柱温是影响柱效及分离度的重要因素，偏高的柱温能在一定程度上提高柱效，缩短分离时间，但会导致结构相似的成分之间的分离度降低。本实验先后比较过25 ℃、30 ℃、35 ℃条件下的色谱行为，发现芹菜素与异鼠李素的分离度均较差，柱温降到23 ℃后，峰型显著改善。
综上所述，本研究发现了泌感合剂其中可用于含量测定的6种黄酮类成分，方法稳定、可靠，从多成分、多靶点的角度对泌感合剂的质量标准做出补充，有利于更好地控制产品质量。
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（2020-02-04收稿 本文编辑：吴珊）
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