不同工艺即食烤鱼多环芳烃检测方法及变化研究

张 艳，王圣开，程 燕，肖跃华，付 勋，冯婷婷

（1.重庆三峡职业学院农林科技学院，重庆 404155；

2.重庆市万州食品药品检验所，重庆 404000）

烤鱼是重庆三峡库区的特色美食，因其口味奇绝、营养丰富深受消费者喜爱。烤鱼多元化发展过程中，即食型烤鱼产品工艺的开发打破了烤鱼现场烤制、现场消费的局限性，有利于烤鱼市场的拓展。烤鱼富含蛋白质、脂肪，在加工过程中产生多环芳烃等物质影响产品的质量安全。

多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs），具有两个或两个以上苯环和稠环的有机污染物。PAHs具有致癌性、诱变性和致畸性。已证实，人群PAHs的摄入量与乳腺癌、皮肤癌、肺癌等的发生有相关性。此外，PAHs还可能引发糖尿病、心血管疾病等，PAHs在多个国家成为重要的安全监测指标。美国环境保护署（EPA）根据环境中PAHs 的发生和致癌性选择了16种优先监测的PAHs，简称 EPA16。欧盟食品安全局（EFSA）规定，熏烤肉类和熏烤水产品中苯并[a]芘的含量不得大于 2 μg/kg，4 种 PAH（苯并 [a]蒽、苯并 [b]荧蒽、苯并[a]芘和䓛）含量之和不得大于12 μg/kg。我国国家标准GB 2762-2017规定，熏、烧、烤肉类和熏、烤水产品中苯并[a]芘的含量不得大于5 μg/kg。

食品中PAHs主要来源于自然界天然存在、环境污染及食品加工过程等。近年来，国内外学者对于PAHs的研究报道较多，主要集中在土壤、食品及接触材料安全性评价、食品中PAHs检测方法优化及食品加工中PAHs的影响因素研究等方面。已证实食品中PAHs的生成量与加工方式、加热条件、抗氧化剂及脂质等因素有关，Farhadian等发现木炭、煤气和烤箱三种烧烤方式中，烤箱烤鸡中PAHs 含量最低为3.51 μg/kg；
油菜籽中PAHs含量随焙炒温度和时间的增加，PAHs含量呈上升趋势；
脂质的不饱和程度越高，PAHs的形成也越多；
抗氧化剂对肉制品中PAHs的形成有抑制作用。综上所述，食品中PAHs的研究报道较多，但对不同工艺即食烤鱼PAHs的变化研究报道较少。本研究采用固相萃取/高效液相色谱-荧光/紫外法（Online-SPE/HPLC-RF/SPD）进行即食烤鱼中EPA16的检测方法验证，对比传统碳烤、油炸、电烤三种熟化方式下即食烤鱼中EPA16种类和含量的差异，分析不同工艺参数对EPA16含量的影响，以期为即食烤鱼安全生产提供理论依据。

1.1 材料与仪器

烤鱼片 实验室自制；
乙腈、正己烷、二氯甲烷色谱纯，上海申博化工有限公司；
MIP-PAHs专用SPE 小柱（1 g，10 mL）、微孔有机滤膜（0.22 μm）迪马科技有限公司；
PAHs混合标准品（EPA16：萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、䓛、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽和苯并[g,h,i]苝、茚并[1,2,3-c,d]芘） 北京曼哈格生物科技有限公司。

LC-20A高效液相色谱仪（带荧光/紫外检测器）日本岛津公司；
AE2202天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
IKA MS3漩涡振荡仪 德国海道尔夫有限公司；
GM200刀式混合研磨仪 德国Retsch公司；
TurboVap 500氮吹仪 德国 Biotage公司；
KH-2000DB超声波振荡器 昆山市超声仪器有限公司；
25型油水混合油炸锅 瑞安市食品机械总厂；
YXD-90C电烤箱 广州市赛思达机械设备有限公司；
实验室常规玻璃仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 混标储备溶液：将 16种PAHs混合标准液（200 μg/mL）用乙腈稀释定容配制成1000 ng/mL的混合标准储备溶液。再稀释成1、5、10、20、50、100、200 ng/mL 的系列标准工作液。

1.2.2 样品制备及预处理

1.2.2.1 工艺流程 鲜草鱼→预处理（鱼肉切分成约2 cm厚的鱼片）→腌制（0.5%浓度的复合磷酸盐、6%浓度的食盐腌制液及少许香辛料中腌制20 min）→熟化→拌料翻炒→真空包装→高压杀菌→冷却→产品

1.2.2.2 样品制备 不同熟化方式样品：腌制后的鱼片沥干水后，实验分成6组。分别采用传统炭火烤制（5 min）、油炸（250 ℃，5 min）、电烤（250 ℃，5 min）熟化烤鱼，至色泽金黄，得到烤鱼片。3组样品以不加调味料为对照，将另3组烤鱼片按相同比例加入相同的麻辣调味料进行翻炒至香，冷却后真空包装。

油炸样品：腌制后的鱼片沥干水后，实验分成8组。4组样品在 200 ℃下分别油炸 4、6、8和 10 min；
4组样品在180、200、220、240 ℃ 下分别油炸6 min，放入滤网中沥干明油，得到烤鱼片，拌料翻炒至香，冷却后真空包装。

电烤样品：腌制后的鱼片沥干水后，实验分成8组。4组样品在 200 ℃ 分别电烤 4、6、8、10 min；
4组样品在180、200、220、240 ℃下分别电烤6 min，得到烤鱼片，拌料翻炒至香，冷却后真空包装。

1.2.2.3 样品预处理 称取2.00 g试样于50 mL离心管中，分别加入10 mL正己烷提取2次，合并两次上清液，氮吹至3～5 mL，待净化。移取待净化液到已活化SPE小柱上，准确加入6 mL正己烷淋洗小柱，并弃去流出液，加入10 mL二氯甲烷洗脱并收集洗脱液，将洗脱液于30 ℃水浴中用氮气缓缓吹至近干。吸取1 mL乙腈复溶混匀，过0.22 μm滤膜，待测。

1.2.3 仪器分析条件 色谱柱：Waters PAHs C柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
检测器：荧光/紫外检测器（因苊烯没有荧光性，采用紫外检测器，其余15种PAHs采用荧光检测器）；
柱温：30 ℃，进样盘温度30 ℃，进样量 20 μL；
流动相：乙腈和水；
流速：1.5 mL/min。梯度洗脱程序、激发和发射波长、紫外波长见表1。

表1 流动相梯度洗脱、PAHs切换色谱时间及检测波长参数Table 1 Parameters of mobile phase gradient elution, PAHs switching chromatography time and detection wavelength

1.2.4 准确度和精密度实验 将1000 ng/mL的标准储备溶液稀释至200 ng/mL，为加标工作液。称取碳烤样品 2.00 g，分别加入 50、100、150 μL 加标液，按1.2.2.3处理后，上机测定。做3个平行加标试验，计算加标回收率及相对标准偏差。

1.2.5 PAHs食用风险评价 以苯并[a]芘（BaP）为标准参考物，其毒性当量因子（Toxic equivalency factors，TEF）为1，各个单体的BaP的毒性当量因子和浓度计算相当于BaP毒性等效浓度（TEQ），计算公式为:

式中：C为第 i种 PAHs的质量浓度；
TEF为第i个PAHs对应的TEF。

本研究采用终生致癌风险（Incremental lifetime cancer risk，ILCR）为度量指标，评价烤鱼中PAHs对人体的致癌风险，计算公式为：

式中：DR为每天的烤肉摄入量，根据调查统计烤鱼人均消费量为0.5 kg/d；
CSF为苯并[a]芘的致癌斜率系数，其值为7.3 mg/kg·d；
EF为暴露频率，d/y；
ED为暴露年数，其值为70年；
BW为体重，取70 kg；
AT为预期寿命，70年。

1.3 数据处理

2.1 16种PAHs检测方法建立

按1.2.1配制标准溶液，在上述色谱条件下进行16种PAHs测定，根据3倍信噪比计算16种PAHs的检出限，结果见表2。在1～200 ng/mL的浓度范围内，校正曲线相关系数在0.9993～0.9998之间，根据3倍信噪比（S/N）确定16种PAHs的检出限范围为0.20～2.50 μg/kg。16 种 PAHs的样品加标回收率为64.25%～122.80%，RSD值范围为 1.38%～7.13%，满足分析检测要求。

表2 16种PAHs的相关系数、检出限、准确度和精密度结果Table 2 Correlation coefficient, detection limit, accuracy and precision test results of 16 PAHs

2.2 不同熟化方式对即食烤鱼中多环芳烃的影响

图1、图2 是采用碳烤（5 min）、油炸（250 ℃，5 min）、电烤（250 ℃，5 min）三种熟化方式下，以不添加调味料为对照（碳烤K、油炸K、电烤K），共6组即食烤鱼中PAHs种类和含量比较。从6组样品PAHs的检出种类分析，主要检出种类为萘、苊烯、芴、菲、芘等轻质 PAHs（2～4 个环），16 种 PAHs中，苊、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝和茚并[1,2,3-c,d]芘在6组样品中均未检出。碳烤样品中检测出PAHs种类最多，为12种，其次为油炸样品，检出9种，电烤样品最少，检出8种。

图1 不同熟化方式烤鱼中PAHs含量Fig.1 PAHs content in roasted fish with different cooking methods

图2 不同熟化方式烤鱼中PAHs总量和PAH4含量Fig.2 Total PAHs and PAH4 contents in roasted fish with different cooking methods

从样品中PAHs的含量分析，碳烤、油炸和电烤三组样品中，PAHs总量、单个PAHs含量及PAH含量均比对照样品（碳烤K、油炸K，电烤K）略低，这可能是因为调味料一定程度上抑制了烤鱼中脂肪的氧化，从而降低了PAHs的生成量。检出的PAHs中，轻质PAHs含量高，其中萘、苊烯、菲和芘检出含量较高。碳烤样品中苊烯、萘检出值分别高达 25.87 和 17.35 μg/kg，PAHs 总量高达 58.74 μg/kg，PAH（苯并 [a]蒽、 䓛 、苯并 [b]荧蒽、苯并 [a]芘）为1.52 μg/kg，明显高于油炸和电烤样品组；
其次是油炸组，PAHs 总量为 36.24 μg/kg，PAH为 0.809 μg/kg；
电烤样品 PAHs总量最低，为 21.71 μg/kg，PAH为0.350 μg/kg。这与Badry提出采用炭火直接烤制对食品中PAHs生成的影响更显著的研究结果相符。油炸样品PAHs检出种类及总量均高于电烤样品组，这可能是因为油炸组不饱和脂质含量高，更易氧化，PAHs的生成量增加。其中我国PAHs重要标志物苯并[a]芘在碳烤和油炸样品中检出，均低于国家限量值（5 μg/kg），但烤鱼中 PAHs安全性有待进一步进行食用风险评估。

2.3 不同油炸工艺对即食烤鱼PAHs的影响

2.3.1 不同油炸时间对PAHs的影响 将鱼片在200 ℃下分别油炸4、6、8和10 min后，其PAHs含量见表3。由表3可知，油炸4、6 min的两组样品均测出8种PAHs，分别为萘、苊烯、芴、菲、蒽、荧蒽、芘和苯并[b]荧蒽；
油炸8、10 min的两组样品检测出上述8种PAHs外，还测出苯并[a]芘。苊烯、荧蒽在油炸 8 min 时含量最高，分别为 5.850、2.650 μg/kg，随着油炸时间的延长，大部分PAHs含量呈显著升高趋势（＜0.05），当油炸6 min时，PAHs含量较油炸4 min样品变化不明显，但当油炸到8 min时，各PAHs含量增加显著（＜0.05），油炸到10 min 时，PAHs总量由18.568 μg/kg 升到 27.083 μg/kg，PAH由 0.252 μg/kg升到0.827 μg/kg。由此得出，油炸温度相同时，油炸时间长，PAHs种类及含量均增加，油炸6 min后，增加趋势加快，这可能是因为油炸6 min后，烤鱼含水量下降较快，烤鱼脂肪发生氧化生成过氧化物进一步内环化形成PAHs。

2.3.2 不同油炸温度对PAHs的影响 将鱼片在180、200、220、240 ℃下分别油炸 6 min，其 PAHs含量变化见表4。由表4可知：180 ℃油炸样品检出6种，均为轻质PAHs；
200 ℃油炸样品检出PAHs 8种；
220、240 ℃油炸样品检出9种，较180 ℃油炸样品增加苯并[b]荧蒽和苯并[a]芘两种重质PAHs。从含量分析，除芴以外，其余检出PAHs随油炸温度升高显著增加（＜0.05），其中含量较高的有萘、苊烯、菲、荧蒽和芘；
萘、荧蒽和芘含量增加约5倍，菲含量增加约3倍。PAHs总量和PAH亦随着温度升高呈增加趋势，当油炸温度为240 ℃时，PAHs总量高达34.27 μg/kg，约为180 ℃油炸样品的3倍。由此得出，相同油炸时间下，油炸温度越高，PAHs含量越高，重质PAHs（5环及以上）如苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘检出率增大。

表4 不同油炸温度下即食烤鱼PAHs的测定值（μg/kg）Table 4 Determination results of PAHs in instant roasted fish at different frying temperatures (μg/kg)

由表3、4得出：油炸时间越长、温度越高，PAHs种类增多，PAHs和PAH总量越高。油炸温度和时间对PAHs影响分析比较，油炸时间对PAHs总量的影响较温度对PAHs影响小，这与Lee等研究结果相符。

表3 不同油炸时间即食烤鱼PAHs的测定值（μg/kg）Table 3 Determination results of PAHs in instant roasted fish at different frying times (μg/kg)

2.4 不同电烤工艺对即食烤鱼PAHs的影响

2.4.1 不同电烤时间对PAHs的影响 鱼片在200 ℃电烤 4、6、8、10 min，4组样品 PAHs变化见表5。电烤4、6 min两组样品检出6种PAHs，均为轻质PAHs；
电烤8、10 min的两组样品检测出上述6种PAHs外，还测出苯并[a]芘。从含量分析，检出的萘、苊烯、菲含量较高，菲在6 min样品检出量最高达4.041 μg/kg；
随电烤时间延长，各检出PAHs含量整体显著增加（＜0.05），其中苊烯增幅最大，电烤10 min样品苊烯含量约为4 min的4倍。PAHs总量随电烤时间亦呈明显增加，电烤4、6 min两组样品PAH未检出。

2.4.2 不同电烤温度对PAHs的影响 将鱼片在180、200、220、240 ℃ 下分别电烤 6 min，其 PAHs含量变化见表6。由表6可见，180、200 ℃电烤样品检出PAHs 6种，未检出PAH；
随电烤温度升高，220、240 ℃电烤两组样品检测出上述6种PAHs外，还检出蒽、苯并[b]荧蒽和苯并[a]芘。除菲、芘、苯并[a]芘外，其余检出的PAHs均随电烤温度升高显著增高（＜0.05），其中苊烯增幅约达5倍。PAHs总量从 12.200 μg/kg 增至 25.023 μg/kg，PAH量从未检出增至0.651 μg/kg。

表6 不同电烤温度即食烤鱼PAHs的测定值（μg/kg）Table 6 Determination results of PAHs in instant roasted fish at different electric roasting temperatures (μg/kg)

由表5、6得出，电烤时间和温度越高，PAHs种类增多，PAHs总量越高。电烤180～200 ℃、时间4～6 min PAH未检出。

表5 不同电烤时间即食烤鱼PAHs的测定值（μg/kg）Table 5 Determination results of PAHs in instant roasted fish at different electric roasting times (μg/kg)

2.5 烤鱼食用风险评估

通过不同加工处理后烤鱼中PAHs的ILCR计算，结果见表7。由表7可知，摄入频率、熟化方式、加热时间和温度均对患癌风险有影响。所有处理组在摄入烤鱼频率为每月1次（12 d/y）时，ILCR均低于1.0×10（USEPA提出 ILCR的可接受标准值），理论上对人体的致癌风险可以忽略；
碳烤烤鱼、油炸和电烤烤鱼（温度200 ℃，时间8 min以上）、电烤烤鱼（温度200 ℃，时间8 min以上或温度220 ℃，时间6 min以上），摄入烤鱼频率大于每月2次（24 d/y）时，ILCR值在10～10之间，具有潜在的致癌风险。因此，从评价模型中可得出，油炸或电烤烤鱼加热时间控制6 min，温度200 ℃以内，摄入烤鱼频率小于每月2次，患癌风险低。

表7 不同工艺烤鱼在人群不同暴露频率的致癌风险评价Table 7 Carcinogenic risk assessment of roasted fish with different processes in different exposure frequencies

本文利用高效液相色谱法测定即食烤鱼中的PAHs含量，16种PAHs相关系数在0.9993～0.9998之间，检出限范围为 0.20～2.50 μg/kg；
加标回收率64.25%～122.80%，RSD值为 1.38%～7.13%，满足检测要求。以不添加调味料烤鱼为对照，碳烤、油炸、电烤三种不同熟化工艺对PAHs种类和含量的影响为碳烤＞油炸＞电烤，其中，萘、苊烯、菲和芘检出含量较高，添加调味料的烤鱼样品中PAHs生成量较对照组低。熟化时间和温度对PAHs种类和含量有影响，油炸时间6 min后，随着油炸时间增长、油炸温度增高，PAHs检出种类和PAHs含量显著增加，PAH亦越高；
油炸温度对PAHs种类和含量影响较油炸时间大，其中检出的萘、苊烯、菲、荧蒽和芘含量较高，重质PAHs检出率越高。电烤时间和温度越高，PAHs种类增多，PAHs总量越高。萘、苊烯含量随电烤时间和温度增幅最大，其中电烤180～200 ℃、时间4～6 min PAH未检出。以终生致癌风险为指标，进行烤鱼食用风险评估，控制烤鱼工艺（200 ℃，6min）和摄入频率（＜2次/月），患癌风险可忽略不计。

检测样品中苯并[a]芘和PAH含量均低于我国国家标准（GB 2762-2017）和欧盟标准，但多个样品中轻质PAHs含量高，轻质PAHs不稳定，容易向重质PAHs转化。在后期工作中着力于即食烤鱼包装、贮藏过程中动态监测PAHs含量的变化，确保即食烤鱼质量安全。

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