绿茶提取物EGCG预防龋病的动物实验研究

时间：2023-02-12 08:50:07 来源：千叶帆本文已影响人

李芳，刘亚军，刘泽婷，陈永翔，王烈成，王一君，王元银

龋病是一种细菌感染性疾病，由含有变形链球菌(

streptococcus

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，

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)的口腔生物膜诱导下牙体硬组织发生的病变。现有研究表明大量的致龋细菌是龋病的致病因素，而

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是龋病的主要病原微生物。

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黏附于牙面获得性膜上，迅速繁殖、代谢碳水化合物产酸，溶解牙体硬组织进而形成龋洞，这是其致龋特性。表没食子儿茶素没食子酸酯( epigallocatechin gallate，EGCG)在儿茶素中含量最多，具有广泛的生物学和药理活性。它还具有较高的抗龋功效，这一特性主要来源于它的抗菌活性，其作用机制与它的化学结构有关。有研究表明，EGCG对口腔主要致龋细菌的产酸、耐酸以及黏附等致龋毒力因子有较好的抑制作用。且有学者证实EGCG在抑菌、保护神经系统及抗氧化等方面起重要作用。该课题前期研究表明EGCG对

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的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)为 6.25 mg/L。该研究利用大鼠龋病模型对绿茶提取物EGCG在 MIC时的防龋效能进行综合评估，为绿茶提取物EGCG进入临床试验提供数据基础。

1.1 试剂与仪器

EGCG、氨苄西林钠购自北京索莱宝科技有限公司；
氟化钠、醋酸氯己定(洗必泰)、紫脲酸铵指示剂均购自上海易恩化学技术有限公司；
头孢拉定胶囊购自石家庄石药集团欧意药业有限公司；
蔗糖购自美国Sigma 公司；

SYTO 9染料购自美国赛默飞世尔科技公司；
NEST 801001 35 mm 玻底培养皿(玻底直径20 mm)购自无锡耐思生物科技有限公司；
SYJ-160型低速金刚石切割机购自沈阳科晶自动化设备有限公司；
激光扫描共聚焦显微镜购自德国卡尔·蔡司公司；
荧光正置显微镜DMI6000B购自德国徕卡仪器有限公司。

1.2 细菌与培养基

国际标准变异链球菌株 ATCC 25175 (血清型C型 ) ；
牛脑心浸出液培养基(brain heart infu- sion，BHI) 购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；
轻唾琼脂培养基(MS 琼脂)、杆菌肽(bacitracin)均购自北京索莱宝科技有限公司等。

1.3 实验动物

SD 大鼠24只购自安徽医科大学实验动物中心；
2000# 致龋饲料购自常州鼠一鼠二生物科技有限公司。

1.4 细菌复苏及培养

按照说明书配制BHI琼脂培养基和MS琼脂培养基。将于-80 ℃冻存的

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株室温复苏24 h后接种于BHI琼脂培养基和MS琼脂培养基，取0.5 ml菌液和4.5 ml BHI液体培养基放入15 ml离心管中混匀，37 ℃厌氧环境 (10% CO、90% N) 培养48 h。BHI琼脂培养基形态学观察为无特征性乳白色菌落；
在超净工作台中用移液枪移取适量菌液涂片革兰染色后显微镜观察为蓝色链球状。确认是纯培养后接种于BHI液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h,使用 BHI液体培养基调节菌液浓度备用，使其达到吸光度值OD=0.6。

1.5 EGCG混悬液的配制

将EGCG粉用灭菌蒸馏水配制成100 mg /L的母液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，4 ℃避光保存待用。使用前用灭菌蒸馏水按设定浓度稀释后使用。

1.6 动物实验

实验分组及细菌接种选择均于出生后第21天断乳的SD雄性大鼠24只，随机分成4组(

=6)：EGCG、氟化钠(NaF)、氯己定(CHX)及蒸馏水(对照)组，给大鼠打耳标、记录体质量。给予大鼠普通饲料适应性喂养2 d，之后给予致龋饲料 2000# 和 5%蔗糖水溶液，直至整个实验结束。鼠龄22 d，异氟烷吸入麻醉，用无菌棉签蘸取大鼠唾液，PBS稀释后涂BHI琼脂平板和MS琼脂平板，观察大鼠口腔内固有菌群情况。在实验第3～6天期间给予广谱抗生素抑制口腔菌群，即1 000 g致龋饲料添加1 g氨苄西林、1 L 5%蔗糖水溶液添加头孢拉定1 g促进

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感染大鼠口腔。在实验第8～12天期间，给每只大鼠口腔内接种国际标准变异链球菌株，菌液浓度为OD=0.6，每次接种1 ml/只，连续处理5 d。在大鼠围术期每组随机抽取3只大鼠，用消毒棉签收集大鼠唾液检测菌株接种情况。

大鼠口腔药物处理自实验第14天起分别用浓度为 MIC的 EGCG、250 mg/L NaF溶液、0.12% CHX溶液及蒸馏水冲洗大鼠口腔。取1 ml各药液分装至1.5 ml EP管，1鼠1支。每只鼠在用药前放入装有3～4个浸满异氟烷棉球的诱导盒内，随即关闭盒盖，等待大鼠完全麻醉 (此过程约需 2～3 min)。可通过轻轻摇动诱导盒以检查大鼠是否完全麻醉，若大鼠身体翻倒为侧姿且没有试着恢复其卧姿状态，则表明该大鼠已经完全麻醉。将大鼠从诱导盒中迅速拿出，左手持大鼠并用拇指和食指固定住其头部，右手拿无菌棉签蘸取药液至饱和，对大鼠磨牙(牙合)面、颊面、舌/腭面及口腔黏膜各处依次清理，剩余药液用钝头的1 ml注射器冲洗大鼠口腔，以确保药液作用到位。每只鼠的药物处理过程为 1 min，处理后将大鼠以侧卧位放回鼠笼，所有大鼠苏醒后禁食2 h，如此连续处理6周，早晚各1次。整个药物处理过程始终由同一实验员操作完成。同时每天观察并记录大鼠健康状况饮食情况，每周记录1次大鼠体质量。

大鼠磨牙标本的制取实验第56天异氟烷窒息处死大鼠，称重后用剪刀断颅，将上下颌骨分开，用组织剪剔除附在骨面的皮肤肌肉筋膜等软组织获取颌骨标本。清洗干燥置于含有1%～2%氢氧化铵溶液的烧杯中浸泡30 min,薄膜封口。取出清洗用滤纸干燥，置于0.4% 紫脲酸胺溶液中避光染色12 h，染色液中加入一定量的10%中性甲醛可以防止颌骨腐烂。取出冲洗室温下避光干燥，将大鼠颌骨用蜡固定在切割机虎钳上，用低速金刚石切割机沿颌骨磨牙牙合面近远中向矢状半切，清洗干燥后放入装有苯的玻璃皿中增加确认率，立即清洁标本，在体视显微镜下根据Keyes评分法评估大鼠磨牙的龋损情况。

龋齿Keyes评分法分级计分 Keyes评分法是一种评估大鼠磨牙龋损程度的传统的计分系统，在下颌第一、第二和第三磨牙中检查的窝沟数目分别为3、2和1。在上颌第一、第二和第三磨牙中分别为2、1和1。分配给每个磨牙窝沟的线性单位分别是：上颌分别为7、5和2；
下颌分别为5、3和2。其中下颌第一磨牙的前沟被指定2个单位的值，并用作其他沟测量的指导或标准。使用4 种探诊深度记录方式[龋损局限于釉质(E 级)；
龋损累及釉质及牙本质外层 1/4 以内(Ds级)，会出现牙本质与上层牙釉质略微分离；
龋损累及牙本质厚度1/4 ～ 3/4(Dm级)；
龋损累及深度超过牙本质厚度的3/4，甚至穿透牙本质全层(Dx级)]评估大鼠磨牙的窝沟龋损情况。对大鼠磨牙的窝沟龋损进行计分，以此来评定药物抑制龋齿情况。其中镜下呈粉红色处是龋损部位，不着色或着色很浅处是正常牙体组织。

2.1

的培养与鉴定

实验中分别在细菌复苏后，接种前及接种后都对细菌进行菌落的形态和革兰染色，形态学观察为无特征性乳白色菌落；
革兰染色后显微镜观察显示细菌呈蓝色链状结构，见图1。结果表明接种细菌为

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，并在大鼠口腔成功定植。

2.2 大鼠的饮食与健康状况

实验过程中对大鼠的水和食物消耗进行记录，各组间未见较大差异。口腔药物处理期间，大鼠的健康活动状况良好，口腔黏膜未见异常表现，各组大鼠的体质量相对均匀增加，实验结束时各组大鼠体质量增加差异无统计学意义(

=1.83，

>0.05)，结果见表1。

表1 实验中大鼠的体质量变化

2.3 大鼠上颌磨牙窝沟龋损的Keyes记分

观察大鼠上颌磨牙牙合面，各组大鼠磨牙窝沟均出现不同程度的龋损。在E级龋齿计分中，与对照组相比，EGCG组计分降低(

=22.09，

<0.001)；
在Ds、Dm级龋齿计分中，3组用药组上颌磨牙Keyes计分分值均降低，但CHX组抑龋效果更好(

=0.001 5；

=0.000 1)；
在Dx级龋齿计分中，与对照组比较，其余各组的龋齿计分均降低很多，且差异有统计学意义(

=31.66，

<0.001)，显示各用药组都有一定的预防窝沟龋齿的作用(表2)，各用药组间龋齿计分差异无统计学意义，大鼠磨牙各种窝沟龋损模型见图2。

表2 各组大鼠上颌磨牙窝沟龋齿的Keyes计分

图1 变形链球菌鉴定

图2 各种龋齿模型紫脲酸铵染色×10

龋齿是世界上最常见的口腔疾病之一，是一种细菌感染性疾病。

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被认为是龋齿发病的主要病因，具有较强的产酸、耐酸性和检出率高等特性。龋齿的发生几乎与细菌对碳水化合物的代谢有关，特别是

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代谢碳水化合物后产生的酸，将降低口腔中的pH，反过来对口腔微生物群施加生理压力。由于其耐酸的特性，

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比不耐酸的物种有竞争优势，当环境条件不太有利时，

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在致龋菌斑数量上占主导地位。它能代谢多种碳水化合物，黏附在牙齿表面，形成生物膜。据报道，

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的高数量与龋齿率的增加有直接关系。EGCG是儿茶素的一种，具有广泛的生物学和药理活性。此外，它还具有较高的抗菌功效，其作用机制与它的化学结构有关。此外它还具有很强的抗氧化活性，可以减少酸性化合物的产生，并通过对细菌胞质膜的不可逆性损伤，发挥对口腔链球菌的抗菌作用。有研究表明，EGCG对口腔主要致龋细菌的产酸、耐酸以及黏附等致龋毒力因子有明显的抑制作用。除了已知的抑菌作用外，EGCG可能还抑制

S.mutans

对牙齿表面的黏附，从而破坏成熟生物膜形成的最初步骤，减少龋齿的发生。该课题组的前期体外研究表明:EGCG 对

S.mutans

的MIC为 6.25 mg/L，说明当药物浓度≥6.25 mg/L就可以抑制

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的增殖。MIC的EGCG对

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的产酸、增殖及黏附有较好的抑制作用。由于细菌-食物-宿主间相互作用的复杂性，研究人员不得不使用动物模型，在控制条件下研究龋齿病变。当喂食致龋食物时，啮齿动物的牙齿可发展龋齿，尽管人类和啮齿动物的牙齿解剖结构不同，但由于它们较易获得且成本较低，开始被应用于龋病的研究。目前关于EGCG对

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作用的研究多集中于体外，尚缺乏EGCG对

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致龋能力影响的体内实验研究。该研究的目的是利用大鼠龋病动物模型研究最低抑菌浓度的EGCG在大鼠口腔内对

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致龋能力的抑制作用。调查EGCG对

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的生长及其体内致龋潜力的影响。Keyes 龋齿计分统计结果显示，EGCG组窝沟面龋损程度少于对照组，且对牙本质深龋有较好的防治作用。表明EGCG具有抑制龋病发生发展的作用。该研究结果发生的机制可能与前期体外实验的结果一致：EGCG可以抑制变链菌的生长黏附、降低牙菌斑的聚集及抑制葡萄糖基转移酶(GTF)的活性。最后，对EGCG的防龋效能进行了综合评估：Keyes 计分表明MIC的EGCG能够抑制大鼠窝沟龋损形成和严重程度。此外，在整个实验过程中，各组大鼠一般健康状况良好，体质量均匀增长，口腔黏膜未见异常表现，与对照组相比饮食的消耗差异无统计学意义，结果显示实验药物经口腔局部应用具有良好的安全性。

该研究表明，MIC的EGCG可减少大鼠磨牙窝沟龋的发生并降低龋损严重程度，且对大鼠饮食和体质量的变化无影响。同课题组前期体外研究结果，从多方面验证了EGCG对口腔致龋菌的抑制作用，表明天然药物EGCG能抑制大鼠口腔变形链菌的生长代谢，可有效预防龋齿的发生，为龋病的防治提供更多的实验依据。推测EGCG可能作为一种天然、安全的防龋药物，在防治龋病方面发挥重要作用。

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