上颌窦区三种种植体表面改性工艺早期成骨能力的比较

时间：2023-02-12 08:50:07 来源：千叶帆本文已影响人

陈永翔,刘亚军, 杨刚,刘鑫,王元银

种植区骨密度及剩余牙槽嵴形态是影响种植体成功的重要因素。上颌磨牙区缺牙后,剩余牙槽嵴发生萎缩,上颌窦气化,同时上颌窦区成骨前体细胞不足血供环境较差的特点,导致此区域植入的种植体常无法在短期形成有效稳定骨结合,导致更长愈合周期。为提高上述成骨困难区种植成功率,缩短愈合周期,众多学者尝试不同工艺改善钛表面。由于临床验证的高成本与困难,上颌窦区直接基于市售种植体表面性能比较的研究报道也较少。该研究通过体外实验比较3种市售种植体表面SLA®、SLActive®、Xpeed®对骨髓干细胞生物学行为的影响,通过兔上颌窦外提升模型,探讨三者早期骨结合能力有无差异,为临床中上颌窦区种植体的应用提供参考依据。

1.1 实验材料与设备

SLA®、SLActive®圆形钛片各50枚,厚度1.0 mm,直径5 mm,由瑞士Straumann®公司研究中心提供。Xpeed®圆形钛片50枚,厚度1.0 mm,直径5 mm,由韩国Megagent®公司研究中心提供。小鼠前成骨细胞系MC3T3E1细胞(中国上海科学院细胞库);DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/链霉素双抗溶液(美国Gibco公司);荧光定量PCR试剂盒、Triton X-100(美国Signa公司);TRIzol试剂(美国Invitrogen公司);PrimeScript RT试剂盒(日本TaKaRa公司);罗丹明-鬼笔环肽鬼笔环肽(北京索莱宝公司);CCK-8试剂盒、DAPI (上海碧云天公司);细胞恒温培养箱、实时定量荧光PCR仪(美国Thermo公司);正置荧光显微镜Leica TCS SP2 (德国Leica公司);微孔板分光光度计(美国Molecular Devices公司);种植机、内径5 mm取骨环钻(美国Biomet3i公司);超声骨刀(中国woodpecker公司)；
Micro-CT(瑞士Scano Medical公司)。

1.2 体外细胞学评价

细胞培养与接种复苏-80 ℃冻存的MC3T3E1成骨细胞,置于37 ℃、95%相对湿度、5% CO恒温培养箱中静置培养。普通细胞培养液含90% DMEM基础培养基、10%胎牛血清、1%青链霉素。每2～3 d换液1次,在细胞密度长至80%～90%时终止培养,PBS冲洗,胰酶消化传代。

细胞黏附铺展观察将钛片分为SLA、SALctive、Xpeed三组,每组各6枚置于24孔板中,制备细胞悬液并调节细胞浓度为2×10个/ml,将细胞悬液按1 ml/孔接种至钛片表面。在培养6、24 h后固定。每个时间点每组取出3枚钛片,2.5%戊二醛固定30 min, PBS浸洗5 min,0.5% Triton X-100通透处理5 min, PBS浸洗3次,5% BSA封闭20 min,室温避光滴加罗丹明-鬼笔环肽荧光标志物100 μl染色30 min,PBS浸洗3次,滴加100 μl的DAPI行细胞核染色,室温下避光3 min后PBS浸洗,吸干,滴加抗荧光淬灭剂适量。在正置荧光焦显微镜下每个样品选5个典型区域进行计数统计,同时观察细胞骨架、细胞铺展情况。

细胞增殖活性检测另取3种钛片各3枚于3块24孔板中,按上述浓度接种培养1、3、7 d后,每个时间点选取一块培养板,吸去培养液,加入CCK-8液37 ℃孵育2 h,酶标仪测定每孔吸光度值(A=490 nm)。

1.3 动物实验

实验动物与分组日本大耳白兔16只,体质量2.5～3.0 kg,随机均分为SLActive组与Xpeed组。所有动物由安徽医科大学实验动物中心饲养,自由饮食,1周无不良反应后用于实验,实验中对动物的处置符合动物伦理学要求。

动物模型建立术前1 d禁食水,称重后以3%戊巴比妥钠按1 ml/kg行耳缘静脉注射,行全身麻醉。用电动理发器于鼻部备皮,俯卧位固定,1%碘伏消毒,铺洞巾。鼻背部辅以皮下碧兰麻辅助浸润麻醉。按参考文献中的方法在上颌骨下缘3～4 mm,鼻背部沿中线做一长约2 cm的垂直切口,切开皮肤和骨膜直达骨面,剥离骨膜,充分暴露鼻骨和鼻切牙骨缝,在距中线约1 cm的两侧,鼻额缝下约2 cm处,在无菌生理盐水充分冷却下,用内径5 mm种植取骨钻切割出圆形骨窗,钝头刮匙轻轻推开骨片,暴露上颌窦黏膜,确认黏膜完整,有气流推出和吸进的稳定呼吸节律。用骨膜分离器自各骨壁轻轻分离窦黏膜,用钝头刮匙从窦底将窦黏膜抬升。

钛片植入每只兔一侧上颌窦植入SLA®钛片作为对照组,另一侧按组别植入SLActive®或Xpeed®钛片。每侧植入后填入100 mg BIO-OSS骨粉,将取下的骨片复位,骨膜和皮肤复位后4/0缝线缝合切口。术后肌注青霉素钠80万单位加外用金霉素软膏3 d,常规饮食,密切观察术区情况,见图1。

qRT

PCR检测术后第4周分别处死SLActive与Xpeed组兔各4只,按原手术入路切开翻瓣暴露骨面,超声骨刀在原术区外切割出10 mm×10 mm矩形骨窗,取出骨粉包裹的钛片,参照TRIzol说明书提取细胞总RNA,参照TaKaRa公司说明书合成cDNA。扩增条件:94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,45个循环。qRT-PCR反应产物由ABI PRISM07700 qRT-PCR系统通过SYBR Green 1检测,以β-actin作为内参对照,检测骨形态发生蛋白2(bone morphogenic protein 2,BMP2)、核心结合因子(Runt-related transcription factor 2,Runx 2)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、I型胶原蛋白(collagen-1,Col-1),引物序列见表1。

图1 兔双侧上颌窦提升和钛片植入手术过程

表1 qRT-PCR引物序列

样本处理在术后第4周分别处死SLActive与Xpeed组兔各4只,切取完整上颌窦的兔上颌骨,10%中性福尔马林固定1周,再换成70%乙醇浸泡后进行micro CT扫描,取钛片周围800 μm空间进行三维重建,对新生骨的骨密度(bone miner density,BMD)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)及骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)进行分析。

2.1 细胞形态学观察

成骨细胞接种6 h后,三组表面细胞核染色计数见图2,各组细胞黏附量差异无统计学意义(

>0.05)。24 h后观察细胞铺展能力如图3,三组钛片均见细胞伸展,罗丹明鬼笔环肽标记的细胞骨架肌动蛋白清晰,呈有规律的平行排列,将细胞定向拉伸呈长条形,细胞形态更为典型,细胞伸出细小伪足状结构,SLActive与Xpeed组之间无明显差异,接种于SLA组表面的细胞伸展更有限,伪足很少。

图2 6 h MC3T3E1细胞DAPI胞核染色与细胞黏附计数 ×100

图3 24 h三组钛片表面细胞黏附染色 ×400

2.2 CCK-8检测结果

三组钛片细胞增殖水平均随时间延长而逐渐增高。在培养的第3天与第7天,SLActive与Xpeed两组相比与SLA组差异有统计学意义(

=68.32,

<0.05),SLActive与Xpeed两组间钛片的增殖活性差异无统计学意义,见图4。

图4 CCK-8细胞增殖检测

2.3 qRT-PCR成骨相关基因表达量检测

4周时各组钛片成骨基因相对表达量显示，Xpeed组成骨相关基因相对表达量最高，见图5。其中BMP2(3.827±0.16) (

=167.60,

<0.001),Runx2(1.730±0.10)(

=66.74,

<0.01),Col-1(2.001±0.21)(

=155.50,

<0.01),OCN(2.310±0.30)(

=141.90,

<0.01)，差异有统计学意义。

图5 4周成骨相关基因表达量

图6 4周时micro CT三组钛盘周围三维重建及扫描图像

2.4 Micro CT参数分析

三组钛片的三维重建结果如图6,分析显示Tb.Th与Tb.sp三组差异有统计学意义,BMD、Tb.N三组差异无统计学意义。Xpeed组显示出最高的Tb.Th(

=49.78,

<0.05)与最小的Tb.sp(

=64.24,

<0.05)，见表2。

表2 4周时各组骨密度及骨小梁参数指标

形貌结构和化学特性是影响种植体表面骨结合的两大因素。士卓曼公司的SLA®表面通过0.25～0.50 mm的大颗粒刚玉砂粒进行喷砂,盐酸酸蚀来制造。这种处理虽然可以增加表面粗糙度,去除表面污染物并增加金属的表面能,但高表面能也吸附无机阴离子或有机烃类污染物,暴露在大气内几分钟,表面化学组成即会改变,亲水性也随之降低,导致SLA表面倾向于具有低表面能与疏水性,在此基础上改良出的SLActive®表面在氮气保护下冲洗,以防止暴露于空气中,然后储存在含有等渗NaCl溶液的密封玻璃管里以防止大气中有机物的污染,从而维持住高表面能与亲水性,相关研究显示改良型的SLActive®表面较SLA®能够促进细胞分化,早期加快骨结合。Xpeed®表面使用含钙和磷的可吸收研磨介质(resorbable blast media,RBM)喷砂后再在含钙溶液中经阳极氧化处理制备。已经有报告指出其植入人体后1个月表面即有新骨的生成。

成骨相关细胞如骨髓间充质干细胞在材料表面的黏附增殖分化是新骨形成的基础。因此,通过体外实验观察不同材料表面细胞生物学行为可以窥见材料植入体内以后的成骨能力。该实验以SLA®钛片作为对照,研究SLActive®与Xpeed®表面MC3T3E1细胞的生物学行为,显示三组钛片在6 h时细胞黏附水平差异无统计学意义。这可能是由于SLActive®表面保持亲水性但未改变粗糙度,而亲水性对细胞附着的改善作用发生在最早期的1～2 h,较长时间后已经没有差异,SLA®表面与SLActive®表面黏附能力接近的结果也同先前研究相一致,Xpeed®表面可能是通过RBM产生相似的粗糙形貌,因而在早期细胞黏附上显示出较高的水平。该实验CCK-8检测结果提示3种种植体表面均有良好的生物相容性,SLActive与Xpeed组之间增殖能力差异无统计学意义可能是由于虽然Xpeed组钛片具有释放钙离子的能力,但7 d的释放量对细胞增殖几乎没有影响。

上颌窦循环压力的特殊力学环境产生生理性机械刺激,会对细胞的分化与成骨过程产生影响,Zhang et al研究了周期性负压力学环境下对人骨髓间充质干细胞的影响,结果显示负压组的细胞形态较对照组由常规的纺锤型变为多边形并伴有更多的突起。虽然负压组细胞增殖率低于对照组,生长曲线也明显发生了代表迟缓的右移,但使得骨形成相关基因的mRNA表达量增加,骨吸收相关基因表达被抑制,显著地提升了真空组细胞ALP的活性,同时检测到了Col-1、缺氧诱导因子-1(HIF-1a)、血管内皮生长因子(VEGF)的产生。兔上颌窦结构与人类似,于鼻腔开口并通过鼻腔进行气体交换,可模拟人上颌窦中节律性呼吸的环境,兔上颌窦解剖位置相较狗更表浅,手术视野好,不需要拔牙与分离神经血管术,适合用钛片建立短观察周期的上颌窦外提升动物模型。兔体内实验显示出4周时不同表面的植入物上成骨基因表达存在差异。BMP 2作为成骨分化中一种重要的转录因子,可通过多种信号通路调节其下游的相关基因Runx2、OCN、Col I的表达。该研究结果显示,植入兔上颌窦4周后,Xpeed组的BMP 2、Runx2、OCN、Col I的mRNA表达水平相对高于SLA、SLActive 组。Micro CT使用锥形X线束,扫描精准度高速度快。相比于传统的切片分析,能够在不破坏标本的情况下对骨组织形态学进行更精准的评价,直接获取骨微结构三维层面的数据,更客观的反映骨组织的量与质的情况。BMD与骨的代谢和改建密切相关,反映骨组织中矿物质的含量。实验结果显示4周时骨矿物质的量上,Xpeed与SLActive组间BMD没有差异而高于SLA组，上述3种骨小梁相关微结构的数据结果显示Xpeed组在4周时形成的骨小梁平均厚度更大,小梁间的离散度更小,提示Xpeed®表面形成的骨质更加致密,骨结构更好。

综上所述,该实验显示Xpeed®表面拥有良好初期细胞的黏附与增殖能力,在植入上颌窦区的早期较SLActive®表面表达更高的成骨相关基因,新生骨的骨小梁厚度与致密度均高于SLActive®表面,能更好地促进上颌窦成骨困难区的骨结合,为临床应用选择提供了参考。但Xpeed促进上颌窦内早期成骨的机制尚需要进一步研究。

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