应用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时检测城市污水中氟胺酮及2种位置异构体
时间：2023-02-12 20:45:05 来源：千叶帆 本文已影响人
王 平，刘晓云，郑振成，梁桂巧，赖胜强
（广州正孚检测技术有限公司 广东正孚法医毒物司法鉴定所，广东 广州 510663）
近几年来，随着国家禁毒部门对污水流行病学（Wastewater-Based Epidemiology,WBE）应用于毒情监测的认可和推广，全国掀起了相关检测与科研工作的热潮。WBE最早由环境科学家提出，起源于违禁药品的消费调查。2001年，美国国家环境保护局环境科学家DAUGHTON首次提出基于市政污水分析的估计药物消费方法。WBE在调查成瘾性物质、毒品等方面具有巨大的优势，且相比传统流行病学，该方法具有可提供客观的、连续的以及实时数据的优势。我国污水毒品流行病学的研究起步较晚，最早的流行病学研究起源于国际合作，KHAN等首次报道了我国北京、广州、深圳和上海四大主要城市的毒品消费情况。随着WBE的成熟应用和推广，新精神活性物质也逐渐得到国内外禁毒领域专家的关注，并开始将新精神活性物质的监控纳入各地常规监控范围。
2021年5月11 日，公安部、国家卫生健康委员会和国家药品监督管理局联合发布《关于将合成大麻素类物质和氟胺酮等18种物质列入〈非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录〉的公告》，正式决定整类列管合成大麻素类新精神活性物质，并新增列管氟胺酮等18种新精神活性物质。自2021年7月1日起，氟胺酮（2-fluoro Deschloroketamine，2-FDCK）正式作为国家管制化学物品进行列管。
氟胺酮的麻醉效果与氯胺酮类似，但在有效剂量和苏醒时间上优于氯胺酮。根据现有动物实验数据可知，氟胺酮的半数致死量LD50与氯胺酮相当，但其半数抑制浓度IC50明显高于氯胺酮，即氟胺酮在动物实验层面上的毒性小于氯胺酮，但仍不能忽略氟胺酮的不良反应：幻觉、意识丧失、抽搐、运动抑制、高血压、心动过速，部分会出现呼吸抑制、恶心呕吐、肝肾功能紊乱等。
本轮列管的氟胺酮为2位氟取代的氟胺酮（2-FDCK），列管通知发布后，很多互联网化工交易平台随即出现了3位氟取代的氟胺酮（3-fluoro Deschloroketamine，3F-DCK）和4位氟取代的氟胺酮（4-fluoro Deschloroketamine，4F-DCK），2-FDCK、3F-DCK与4F-DCK的化学结构式如图1所示。由于氟元素取代的位置均在氟胺酮的苯环上，因此3F-DCK、4F-DCK在色谱保留和质谱特征上与已列管的2-FDCK相似，容易在污水毒品检测的各类实践中产生误判。本文建立了污水中氟胺酮及2种位置异构体的分析方法，以期为毒品、毒物检测工作者更好地理解和区分氟胺酮及2种位置异构体提供理论依据。
图1 氟胺酮及2种位置异构体的化学结构式
1.1 仪器与试剂
LCMS-8045型超高效液相色谱质谱联用仪（日本岛津公司）；
SPE Ware CEREX48TM固相萃取氮吹仪（瑞士帝肯公司）；
Sorvall ST16R型高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司）；
Milli-Q型超纯水机（德国默克公司）；
CNW Poly-Sery MCX型固相萃取柱（60mg/3mL，上海安谱实验科技股份有限公司）；
1.2 μm玻璃纤维滤膜（上海兴亚净化材料厂）；
CNW柱管（60 mL）及柱管连接件转换接头（上海安谱实验科技股份有限公司）。
2-FDCK（纯度为98%）、3F-DCK（纯度为98%）、4FDCK（纯度为98%）均购自美国Cayman Chemical公司；
内标物氟胺酮-D（Ketamine-D，美国Cerilliant公司）；
甲醇、乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯（德国默克公司），其余试剂均为市售分析纯；
实验用水为Milli-Q型超纯水机制备的超纯水。
实验中的空白污水样品均采集自广州市黄埔区市政污水的瞬时样，经实验室检测均不含氟胺酮及2种位置异构体。其他测试样品均通过水质采样器采集12个瞬时样品（每2 h采集1次）等体积混合于预置有盐酸的采样瓶中，采集过程中保持在-20℃下进行，单样采样体积为600 mL。
氟胺酮及2种位置异构体的标准储备溶液：1 mg/mL，分别准确称取氟胺酮及2种位置异构体标准物质5 mg，用甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中，用甲醇定容，使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。
氟胺酮及2种位置异构体的工作溶液系列：用甲醇将氟胺酮及2种位置异构体标准储备溶液逐级稀释配制为10、100 μg/L的工作溶液系列。由于氟胺酮位置异构体的标准物质均为盐酸盐，因此以上溶液的质量浓度均为其盐酸盐的质量浓度。
氯胺酮-D（KET-D）内标储备溶液：100μg/mL，氟胺酮的市售同位素内标较难获取，实验将氯胺酮的同位素内标氯胺酮-D（KET-D）作为氟胺酮及2种位置异构体的通用内标，使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。
KET-D内标工作溶液：100 μg/L。
1.2 方法
1.2.1 仪器工作条件
色谱条件 日本岛津GL Sciences Intersil HILIC（3.0 mm×150 mm，3 μm）色谱柱；
柱温为30℃；
流动相A为10 mmol/L乙酸铵，流动相B为乙腈；
流量为0.28mL/min；
进样量为1μL；
采用体积比为98∶2的乙腈-10 mmol/L乙酸铵等度洗脱。
质谱条件 离子源为电喷雾离子源（Electron Spray Ionization,ESI）；
检测方式为电喷雾离子源正离子模式（ESI）；
扫描方式为多反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring,MRM）；
接口电压为4.5 kV；
雾化气（氮气）流量为3.0 L/min，干燥气（氮气）流量为10.0 L/min，加热气（氮气）流量为10.0 L/min；
接口温度为300℃，脱溶剂管温度为250℃，加热模块温度为400℃；
碰撞气为氩气（230 kPa）。其他质谱参数见表1。
表1 氟胺酮及2种位置异构体和内标物质的质谱参数
1.2.2 样品处理过程
用盐酸溶液调节污水样品的pH值约为2，在高速冷冻离心机中以12 000 r/min的转速离心5 min，取上清液经玻璃纤维滤膜过滤去除固体颗粒物，取50 mL过滤后的水样，分别加入质量浓度为100 μg/L的工 作内标溶液30 μL，充分摇匀后待固相萃取富集净化。使用CNW Poly-Sery MCX固相萃取柱进行富集净化，固相萃取柱经过4 mL甲醇、4 mL pH为6.0的磷酸缓冲盐（PBS）缓冲液活化。加入水样，为保证固相萃取柱的填料与水样中目标物的充分吸附，上样过程不加压。上样完成后，依次加入2 mL去离子水、2 mL 0.1mol/L盐酸溶液，41.4 kPa氮气正压吹干1 min；
加入2 mL甲醇和2 mL乙酸乙酯，206.9 kPa氮气正压吹干5 min，完成杂质的清洗工作；
再加入4 mL体积比为78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液，以洗脱目标物成分。洗脱液经氮吹仪正压40℃吹干，加入100 μL体积比为1∶1的含0.05%（体积分数，下同）甲酸的5 mmol/L乙酸铵-甲醇混合溶液复溶残留物，经过0.22 μm有机系滤膜过滤，取上清液待上机分析。
1.3 方法学验证
1.3.1 工作曲线、检出限与定量限
城市污水中常见的毒品类型甲基苯丙胺的滥用质量浓度可达100 ng/L以上，针对新型氟胺酮类毒品，因其滥用的群体覆盖区域和人员远不及传统毒品甲基苯丙胺，大型城市的污水处理厂、泵站等污水典型采样位点的质量浓度通常低于50 ng/L。
准确量取50 mL空白污水样品，加入质量浓度分别为10、100 μg/L的氟胺酮及2种位置异构体混合标准溶液，并用甲醇逐级稀释为质量浓度分别是1、3、5、8、10、30、50、80 ng/L的工作溶液系列，各添加样品中加入质量浓度为100 μg/L的内标氯胺酮-D溶液30 μL，按照实验方法进行测定。以氟胺酮及2种位置异构体的质量浓度为横坐标，以氟胺酮及2种位置异构体峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，以不强制过零点、不对曲线进行加权的方式绘制工作曲线。
1.3.2 准确度与精密度
使用空白污水基质配制低、中、高（3、50、80 ng/L）3个质量浓度的质控样品各6份，按照实验方法进行测定，每个质量浓度的样品连续测定5 d，求得各目标物准确度与精密度的平均值。
1.3.3 回收率与基质效应
取适量氟胺酮及2种位置异构体的混合标准溶液加入空白污水基质中，配制成质量浓度分别为3、50、80 ng/L的添加样品，按照样品处理过程对空白污水和添加样品进行处理，计算氟胺酮及2种位置异构体的回收率。
在日常污水检测过程中，经常利用不同类型的水源来制备添加样本，而不同来源、性状的水对监控目标物的基质效应存在一定的差异。实验对已知空白污水、广州市自来水、屈臣氏纯化水这3种常见基质水的基质效应进行考察。按照实验方法对3种空白基质水进行固相萃取，萃取洗脱液吹干后加入100 μL质量浓度分别为1.5、25、40 μg/L的氟胺酮及2种位置异构体混合工作溶液（相当于3、50、80 ng/L的添加质量浓度），计算各物质的基质效应。
2.1 氟胺酮位置异构体的定性判定
在质谱离子对丰度比上，氟胺酮及2种位置异构体的特征离子对一致，3种物质的定量离子对均为222.1/109.2，另外两对离子对222.1/163.2、222.1/191.2的相对离子对丰度比存在一定的差异，对位氟取代4F-DCK的离子对222.1/191.1相对丰度比最高，其次为间位氟取代3F-DCK，最后为邻位氟取代2-FDCK，而222.2/163.1离子对的相对丰度比相对差异较小。
2.2 方法优化
2.2.1 色谱柱的选择
氟胺酮及2种位置异构体因其结构的相似性，色谱保留时间和质谱特征离子对的差异较小。实验比较了亲水作用HILIC色谱柱、五氟苯基和联苯基键合填料的色谱柱对氟胺酮及2种位置异构体分离效果的影响。结果表明：五氟苯基和联苯基键合填料的色谱柱在色谱保留上不能有效分离氟胺酮及2种位置异构体，无法达到基线分离，并且即使调整有机相比例、水相组成也不能明显改善氟胺酮及2种位置异构体的分离度；
通过采用亲水作用的HILIC色谱柱并调整流动相比例，可将氟胺酮及2种位置异构体进行有效分离。因此，实验选择的色谱柱为亲水作用的HILIC色谱柱。
多反应监测模式下质量浓度为10 ng/L的氟胺酮及2种位置异构体的色谱图如图2所示。
图2 氟胺酮及2种位置异构体的色谱图（质量浓度为10 ng/L）
2.2.2 流动相及其流量的选择
实验选择的亲水作用HILIC色谱柱通常将乙腈作为流动相中的有机相。结果表明：为有效分离氟胺酮及2种位置异构体，实验将有机相乙腈的比例从80%递增至100%时，发现可显著改善氟胺酮及2种位置异构体的分离度；
当有机相乙腈的比例低于90%时，2-FDCK和3F-DCK的多反应监测模式色谱图存在部分重合；
当有机相乙腈的比例高于98%时，3F-DCK的多反应监测模式色谱图的峰形发生明显分裂。因此，实验选择流动相中的有机相为98%（体积分数，下同）的乙腈。
实验进一步考察了流动相的流量分别为0.1、0.2、0.25、0.3 mL/min时对氟胺酮及2种位置异构体色谱峰形与分离度的影响。结果表明：当流量高于0.3 mL/min时，2-FDCK和3F-DCK的色 谱 分 离度较低，无法达到基线分离；
当流量低于0.2 mL/min时，4F-DCK的色谱峰形过宽。综合考虑，实验选择流动相的流量为0.28 mL/min。
2.2.3 洗脱剂种类的选择
实验比较了氨化的甲醇[含2%（体积分数，下同）氨水的甲醇]和体积比为78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液的洗脱效果以及在氮吹吹干时间上的差异。结果表明：以含2%氨水的甲醇作为洗脱溶剂时，提取回收率比以体积比为78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液的提取回收率高约20%，但在洗脱时间、氮吹吹干的时间明显更长。综合实际应用情况，实验在保证洗脱效果和前处理时间平衡的前提下，选择以体积比为78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液作为洗脱溶液。
2.3 方法学验证结果
2.3.1 工作曲线、检出限与定量限
氟胺酮及2种位置异构体的线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限（3×/）和定量限（10×/），结果见表2。结果表明：氟胺酮及2种位置异构 体 在1～80 ng/L内 线 性 关 系 良 好，2-FDCK、3F-DCK、4F-DCK的最低检出限分别为0.2、0.3、0.4 ng/L，最低定量限均为1.0 ng/L。
表2 线性参数、检出限和定量限
2.3.2 精密度和准确度实验
氟胺酮及2种位置异构体在不同质量浓度下的准确度为94.7%~101%，日内精密度和日间精密度为2.7%~8.1%，详见表3。
表3 污水中氟胺酮及2种位置异构体的精密度、准确度、回收率和基质效应
2.3.3回收率和基质效应
空白污水样品基质的基质效应平均值见表3。结果表明：空白污水样品基质对氟胺酮及2种位置异构体均体现出基质减弱效应；
氟胺酮及2种位置异构体的回收率为69.5%~108%。
2.3.4 延迟效应
将氟胺酮及2种位置异构体混合标准溶液加入空白污水基质中，配制成质量浓度为500 ng/L的添加样品。按照实验方法对其平行测定6次，每个添加样品进样后增加3针空白流动相进样，以监测不同来源污水的高浓度添加样品的延迟响应。结果表明：高浓度进样的各目标物残留响应值低于其各目测物定量限响应值的10%，这说明高浓度延迟对水样中各目标物测定结果的影响可忽略不计。
2.4 实际样品分析
按照实验方法对华南地区某省一县级市8个疑似有氟胺酮滥用的污水处理厂（含泵站）的实际样品进行分析，每个样品测定2次，以碱型质量浓度计算，氟胺酮及2种位置异构体的测定结果见表4。
表4 8个城市污水样品中氟胺酮位置异构体的测定结果（ng/L）
北京大学李喜青教授团队于2022年首次发表污水中氟胺酮（2-FDCK）的检测和评估方法，通过污水监控分析了国内氟胺酮的滥用水平呈逐年递减的趋势。本研究监控的8个位点的氟胺酮与李喜青教授报道的国内滥用水平符合性较好。目前，国内外针对氟胺酮的检测尚未涉及氟胺酮的位置异构体，从检测结果来看，我国部分地区已少量存在3F-DCK滥用的情况。为科学评估、有效监管氟胺酮及其位置异构体的滥用水平，各地可根据毒情形势适时建立对应的分析和评估方法。
本文建立一种可同时检测城市污水中氟胺酮及2种位置异构体的固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱分析方法，该方法具有较高的准确度和可靠性，为精准掌握氟胺酮及2种位置异构体的滥用信息提供了技术保障。
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