GHRL基因多态性与黔东南小香鸡生长性状的关联性分析
时间：2023-02-13 17:10:08 来源：千叶帆 本文已影响人
周 迪， 赵忠海， 李建伟， 李 俊， 杨 蓉， 陈昌雪， 袁 勇， 严兴烨， 林 习
(1. 贵州省种畜禽种质测定中心，贵州 贵阳 550018；
2. 遵义市畜牧渔业站，贵州 遵义 563000)
生长素(Ghrelin，GHRL)是1种胃分泌的食欲诱导肽，是生长激素促分泌受体(GHSR)的内源性配体[1]。相关研究表明，GHRL具有调节动物机体生长发育、维持体内能量平衡等功能[2，3]；
GHRL基因对动物的生长发育有显著影响。何丹林等[4]研究显示，鸡GHRL基因C2100T位点多态性与鸡的部分生长性状存在显著相关性。Fang M等[5]研究表明，GHRL基因外显子的1个8 bp插入/缺失多态性与鸡生长性状和屠宰性状显著相关，而GHRL基因部分单核苷酸多态性(SNP)与鸡腹脂重量、腿肌蛋白含量显著相关。Nie Q等[6]研究表明，GHRL基因与鸡和鸭的脂肪沉积相关，且属于1种正向调控。李红伟等[7]报道，惠阳胡须鸡GHRL基因单核苷酸突变对体重无显著影响，但突变型个体的体重均值高于野生型。黔东南小香鸡是贵州特有的肉蛋兼用型地方鸡种，具有耐粗饲、抗逆性强、肉味鲜美等特点，具有一定的地方特色和市场开发前景。本研究以GHRL基因作为候选基因，筛选有利于黔东南小香鸡生长性状选育的遗传标记位点，为地方家禽品种的选育、开发和利用提供参考依据。
1.1 试验材料以272只300日龄黔东南小香鸡(母鸡176只，公鸡96只)作为试验材料，由贵州省榕江县小香鸡保种场提供。翅静脉采血(EDTA抗凝)，用冰盒带回实验室，-20 ℃保存备用。
1.2 主要仪器凝胶成像系统(型号：GBox-F3，美国Syngene公司)、核酸电泳仪(型号：JY600E，北京君意东方电泳设备有限公司)、梯度PCR仪(型号：ABI Veriti，美国应用生物系统公司)。
1.3 主要试剂E.Z.N.A.Gel Extraction Kit(血液基因组DNA提取试剂盒，OMEGA-BIO-TEK公司)、2×TaqMaster Mix(Dye Plues)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、REGULAR AGAROSE(琼脂糖，Hispanagar S A公司)、GoldView(Ⅰ型核酸染色剂，北京索莱宝科技有限公司)、TAE缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)。
1.4 基因组DNA提取根据血液基因组DNA提取试剂盒说明书方法提取血样基因组DNA，利用微量紫外分光光度计对所提取的DNA进行纯度和浓度检测，DNA样品保存于-20 ℃备用。
1.5 引物设计参照NCBI(美国国立生物技术信息中心)的鸡GHRL基因4个外显子序列(登录号：NC_052543.1)，利用Primer 5.0引物设计软件设计4对特异引物。引物由安徽通用生物系统有限公司合成，详细信息见表1。
表1 GHRL基因4对外显子引物信息
1.6GHRL基因外显子PCR扩增采用PCR反应体系30 μL：2×TaqMaster Mix 15 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 2 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 9 μL。
反应程序：95 ℃预变性3 min；
95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；
72 ℃终延伸 7 min。
PCR产物4 ℃保存，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.7GHRL基因测序及序列分析将PCR扩增产物送至安徽通用生物系统有限公司进行GHRL基因4个外显子测序，测序结果利用DNAstar软件进行拼接比对，并与GenBank公布的参考序列(NC_052543.1)进行序列比对。
1.8 生长性状指标测量生长性状指标(体重、体斜长、胸宽、胸深、胸围、胫长、胫围、龙骨长、髋骨宽)测量参照《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》(NY/T 823—2020)。(1)体重：禁食12 h，电子天平测量体重；
(2)体斜长：卡尺测量肩关节至同侧坐骨结节间的距离；
(3)胸宽：卡尺测量两肩关节间的距离；
(4)胸深：卡尺测量第一胸椎到龙骨前缘的距离；
(5)胫长：卡尺测量跖骨上关节到第三、四趾之间的直线距离；
(6)胫围：皮尺测量胫中部的周长；
(7)胸围：皮尺测量胸部第一、二肋骨处的周长；
(8)龙骨长：卡尺测量龙骨突前端到龙骨末端的距离；
(9)髋骨宽：卡尺测量两髋骨结节之间的距离。
1.9 数据统计用Excel 2010对生长性状数据进行统计，结果以“平均值±标准差”表示。用DNAstar软件对基因测序结果进行比对，SPSS 18.0 软件的一般线性模型(GLM)进行生长性状关联性分析。
2.1 PCR扩增产物检测由图1可见：扩增产物与预期设计一致，条带清晰明亮，可以进行下一步实验。
M：DL 2 000 DNA Marker；
1：外显子1(437 bp)；
2：外显子2(338 bp)；
3：外显子3(333 bp)；
4：外显子4(507 bp)图1 GHRL基因4对外显子的PCR产物凝胶电泳
2.2GHRL基因序列分析由图2可见：在黔东南小香鸡GHRL基因第2外显子发现1个g.319A>C突变位点，碱基由A突变为C。
图2 GHRL基因g.319位点碱基突变
2.3GHRL基因遗传学分析将测序结果进行比对，在黔东南小香鸡GHRL基因第2外显子发现g.319A>C位点突变，该位点处于GHRL基因启动子区5’调控端，将该多态位点所对应的纯合子和杂合子基因型分别定义为AA、CC、AC型。由表2可见：AC为优势基因型，等位基因C为优势等位基因；
卡方(x2)检验发现，该基因位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，群体纯合度(Ho)为0.536 0，杂合度(He)为0.464 0，多态信息含量(PIC)为0.356 3(>0.25，<0.5)，属于中度多态。
2.4GHRL基因g.319A>C位点与生长性状的关联性由表3可见：CC基因型个体胫围显著高于AC型(P<0.05)，而CC型与AA型、AA型与AC型之间差异不显著(P>0.05)；
CC基因型个体龙骨长显著高于AC基因型个体(P<0.05)，与AA基因型个体之间差异不显著(P>0.05)，但AA基因型个体与AC基因型个体之间龙骨长差异不显著(P>0.05)；
不同基因型个体公鸡的各项指标均高于母鸡。
表3 GHRL基因g.319A>C位点与生长性状的关联性
本研究发现，在黔东南小香鸡GHRL基因第2个外显子存在1个g.319A>C突变位点，处于启动子区5’调控端。与生长性状数据关联性分析发现，该位点突变CC型纯合子的胫围和龙骨长显著高于AC型杂合子，均值也高于野生型纯合子个体，说明该位点属于有利突变，CC型属于优势个体，可作为黔东南小香鸡分子辅助选育的参考标记位点。
4.1动物的质量性状及数量性状受多个基因控制，找到某个与性状关联的重要候选基因，对于动物遗传育种工作的开展显得尤为重要。相关研究表明，GHRL具有增加食欲、调节能量代谢平衡、促进胃酸分泌和胃肠发育、增强胃肠道功能、改善心血管功能等生理功能，GHRL基因被认为是影响动物机体生长发育的重要候选基因[8～10]。宋桃伟等[11]研究显示，贵州黑山羊的GHRL基因单核苷酸突变所对应的杂合子个体在体重、体高和胸围等性状方面显著高于纯合子个体。李纯等[12]对中华鳖的GHRL基因多态性进行了研究，共筛选到14个SNPs(单核苷酸多态性位点)，其中有8个SNPs对中华鳖的生长性状有不同程度影响，且均呈现出杂合子个体指标高于纯合子个体。方梅霞等[13，14]研究发现，GHRL基因突变对不同日龄鸭的体重、屠宰性状有不程度影响，且杂合子个体高于纯合子个体；
GHRL基因5’侧翼区多态性对鸡及其他家禽生长、屠体性状的影响也得出了相似结论，杂合子优势明显高于纯合子。廖娟等[15]研究显示，黄杂鸡GHRL基因启动子区多态性虽然对龙骨长和胫围存在显著影响(P<0.05)，但却表现出基因型频率较低的AA型(野生型)个体显著高于AG型(杂合型)和GG型(突变型)个体。以上研究表明，GHRL基因单核苷酸突变对动物的生长有一定的促进作用。
4.2本研究以贵州地方家禽品种黔东南小香鸡为研究对象，发现GHRL基因启动子区存在1个A→C突变位点。将该突变位点与黔东南小香鸡生长性状指标进行关联分析发现，CC基因型个体在胫围、龙骨长指标上显著高于杂合子AC基因型个体(P<0.05)，与AA基因型(野生型)个体间虽然差异不显著，但其均值仍高于AA基因型个体，可以推断该位点的突变是有利突变。在鸡的育种过程中，胫的长短、粗细是评定优质肉鸡的1个重要标准，优质肉鸡通常表现为胫粗短，体型结实紧凑[16～19]。徐垭烯等[20]研究表明，龙骨长与鸭的胸肌重、胸肌率、颈长等呈显著正相关，并认为通过测量龙骨长指标选择提高胸肌率的方法是可靠的。可见胫围和龙骨长可以作为家禽育种的重要参考指标。结合本研究结果，黔东南小香鸡GHRL基因g.319A>C突变位点具有潜在的育种价值，可以考虑作为黔东南小香鸡分子辅助选育标记位点。
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