高效液相色谱法用于黄体酮注射液的含量测定*
时间：2023-02-14 13:30:08 来源：千叶帆 本文已影响人
黄孟秋，卢瑞芯，黄泽丹，王涌杰，陈红英
(广州白云山明兴制药有限公司，广东 广州 510250)
黄体酮(Progesterone，又称孕酮)，由孕二醇在黄体生成激素作用下转化成，是临床常用的孕激素类药物，已被广泛应用于各种妇科疾病。黄体酮的荷尔蒙作用是在1929年被发现的，1934年Willard Allen分离出纯净结晶的黄体酮，并与哥伦比亚大学的Wintersteiner在实验室共同测定了其化学结构，将其命名为Progesterone。同年下半年，黄体酮实现了的化学合成，开始被用于临床研究。目前临床上常用的黄体酮制剂主要有口服、注射和阴道给药三种给药途径，肌内注射是最普遍的形式[1-2]。用于肌内注射的黄体酮注射液的适应症为，用于月经失调，如闭经和功能性子宫出血、黄体功能不足、先兆流产和习惯性流产(因黄体不足引起者)、经前期紧张综合症的治疗[3-4]。《中国药典》2020年版中黄体酮注射液含量测定的前处理环节复杂，采用了提取、复溶、离心等方法，整个过程操作繁琐，影响因素较多，尤其是该方法需要将乙醚提取液置具塞离心管中，在温水浴中使乙醚挥散，因乙醚的沸点仅为 34.6 ℃，置离心管中挥发，有爆沸的可能，容易发生意外导致火灾，实际操作中对操作人员而言有较大的风险[5]。结合文献[6-8]，本研究改进了黄体酮注射液含量测定中供试品的前处理方法，大幅简化了药典方法中复杂的前处理环节，更适用于黄体酮注射液的含量测定。
图1 黄体酮化学结构Fig.1 Chemical structure of progesterone
1.1 仪 器
LC-2030 PLUS高效液相色谱仪；
梅特勒托利多XS105电子天平；
天津市泰斯特仪器有限公司DK-98-II电热恒温水浴锅；
AXTG16G高速离心机。
1.2 试 药
乙腈(色谱纯，批号：2020AH006)，康科德；
甲醇(色谱纯，批号：2020MH008)，康科德；
水为实验室制备超纯水；
黄体酮对照品(批号：100027-201810，含量：99.6%)，中国食品药品检定研究院；
黄体酮注射液(规格：1 mL:10 mg，共10个批次)，实验室自制;精制芝麻油(批号：19C3607，SIO，注射级)。
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm色谱柱)；
流动相：水-乙腈(50∶50)等度洗脱；
流速：1.5 mL/min；
进样量：10 μL；
检测波长：241 nm；
柱温：30 ℃；
溶剂为甲醇，进样前溶液均用0.45 μm孔径尼龙滤膜过滤。
2.2 对照品溶液的制备
取黄体酮对照品约20 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即为黄体酮储备液 (0.40 mg/mL)。分别精密量取黄体酮储备液2 mL、4 mL、 5 mL、6 mL、7 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制备得到黄体酮浓度约为16、32、40、48、56 μg/mL的对照品溶液。其中40 μg/mL浓度的对照品溶液作为含量测定用的对照品溶液。
2.3 供试品溶液及阴性对照溶液的制备
精密量取本品2 mL(约相当于黄体酮20 mg)，置50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取供试品溶液5 mL，至50 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取精制芝麻油2 mL，按上述方法操作，即得阴性对照溶液。
2.4 专属性试验和系统适应性试验
分别对阴性对照溶液、对照品溶液和供试品溶液进行分析，考察样品中辅料对黄体酮定量的干扰，根据图2所示，样品中辅料不干扰黄体酮的测定。理论塔板数按黄体酮计算不低于4000。
图2 专属性试验色谱图Fig.2 Specificity test chromatogram
2.5 线性范围
对“2.2”项不同浓度的对照品溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，浓度(μg/mL)为横坐标作标准曲线。得到黄体酮的线性方程为Y=23372030.79X-81485.62，线性相关系数(r)为0.9998，线性范围16.05～55.98 μg/mL，说明方法在该范围内，线性关系良好，符合规定。
图3 线性结果Fig.3 Linearity results
2.6 精密度试验
2.6.1 重复性试验
采用批号为20200717的黄体酮注射液作为供试品，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法，平行制备6份供试品溶液，分别进样分析，计算得到黄体酮含量的RSD(n=6)为0.85%，说明方法的重复性良好。
2.6.2 中间精密度试验
照2.6.1重复性试验方法于不同日期、不同仪器，由不同操作人员，对同一批样品进行含量测定，重复操作6次。6次含量结果的RSD为0.52%，小于2.0%；
12次含量结果的RSD为1.03%，小于2.0%，符合要求。
2.7 准确度
分别精密称取黄体酮对照品各约8 mg、10 mg、12 mg，置不同25 mL量瓶中，按照处方量精密加入芝麻油约0.907 g(相当于芝麻油1 mL)，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别作为80%、100%、120%加标供试品溶液。同法配制三份，共九份样品，进样测定，结果显示，黄体酮的平均加样回收率为 100.2%(n=9)，RSD为0.79%(n=9)，表明方法的加样回收率良好。
表1 准确度试验结果Table 1 Accuracy test results
2.8 溶液稳定性试验
取对照品溶液及供试品溶液于室温避光条件下放置，于 0～48 h，分别精密量取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，考察其溶液稳定性。溶液如在初步拟定的时间或条件内不稳定，可缩短考察时间及改变放置条件。
表2 溶液稳定性试验结果Table 2 Solution stability test results
对照品溶液中，在48 h内的主峰面积变化率最大为1.38%，小于2.0%，即对照品溶液在48 h内稳定；
供试品溶液中，在24 h内的主峰面积变化率最大为1.45%，小于2.0%，即供试品溶液在24 h内稳定，在48 h内的主峰面积变化率最大为2.02%大于2.0%，即供试品溶液在48小时内不稳定。
2.9 样品含量测定
表3 十个批次黄体酮注射液含量测定结果Table 3 Ten batches of progesterone injection content determination results
采用本研究建立的含量测定方法及2020版中国药典的方法，对实验室制备得到的十个批次的黄体酮注射液进行含量测定，每个样品制备供试品溶液2份，含量测定的结果取平均值，测定结果显示该方法与药典方法含量测定结果一致，说明方法准确可靠，用于黄体酮注射液的含量测定具备可行性。结果如表3所示。
3.1 提取过程更简便
药典方法选择乙醚作为提取溶剂，需要将乙醚水浴挥散后甲醇复溶提取物，并需要通过多次振摇后离心的方式去除溶解在乙醚而不溶于甲醇的辅料成分，操作相对繁琐；
本实验采用甲醇溶解黄体酮，操作简单，尽可能减少操作中引入的误差及减少辅料中的成分对黄体酮含量测定时的干扰。
3.2 检验过程更安全
避免乙醚提取液置离心管中挥发，降低试验风险，避免因意外导致火灾，实际操作中对操作人员而言更安全。
3.3 实验过程更快捷
药典方法需要用甲醇振摇4次(5、5、5、3 mL)复溶黄体酮乙醚提取物，每次需振摇10 min，之后还需离心15 min，处理一份样品共计100 min。本实验处理一份样品仅需5 min，相对而言处理过程更快捷。
3.4 含量测定结果准确可靠
本实验在保证检测波长241 nm与药典方法一致的前提下，对供试品前处理方法加以优化，结果显示该方法与药典方法含量测定结果一致，说明方法准确可靠，可用于黄体酮注射液的含量测定。
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