饮料中腐败酵母菌的分离、鉴定及控制研究
时间：2023-02-15 08:40:08 来源：千叶帆 本文已影响人
周 婀，马 瑜
（1.上海康识食品科技有限公司，上海 201101；
2.陕西省微生物研究所，陕西西安 710043）
酵母菌（Yeasts）是一类单细胞真核微生物，以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖，也可通过形成子囊孢子进行有性繁殖[1]。酵母菌对环境的耐受性较强，可在低温、低湿、低pH值、高盐度及高糖度等多数细菌无法生长的环境中生存，因此其广泛分布于各生态位，与人类生活息息相关。食品的特性和加工贮藏的条件可抑制细菌的快速生长和竞争力，同时软饮料自身较低的pH值（通常在2.6～4.0）可抑制大多数细菌及病原菌的生长。因此，在高酸性和/或高糖度条件下，酵母菌是食品及工业饮料中普遍存在的腐败微生物源。虽然腐败酵母菌在已知酵母类群中仅占很小的比例，但其会引起食品感官评价降低，进而引起食品腐败等一系列安全问题[2-3]。食品的腐败变质会造成巨大的经济损失，在新型产品研发和生产中防止腐败是食品科学工作者最关注的一个问题[4-6]。
微生物的生长是导致食品腐败变质的根本原因，腐败酵母菌的生长不仅可改变饮料风味，产生浑浊、沉淀物或絮凝物等腐败变质现象，严重时可导致包装膨胀甚至爆炸[7-8]。食品防腐剂作为食品添加剂的一个类别，可通过干扰微生物的遗传物质及功能蛋白的正常运作抑制微生物的生长，从而达到延长食品保鲜期和保质期的目的[9]。食品防腐剂的应用已成为食品产业链的常态，与人们的日常生活密不可分。在食品中添加合适的防腐剂既可以保证食品的风味又能保证食品安全。不同微生物的致腐能力和特征不同，为研究饮料腐败变质的原因，本研究对出现胀瓶的饮料中的腐败酵母菌进行了分离、纯化、鉴定，确定腐败菌的微生物种类，并以其为供试菌，研究了生产中常用防腐剂对其控制效果，以期为饮料腐败菌的控制及防腐剂的选择、添加提供理论参考数据，从而有效解决其在贮藏过程中因微生物变败胀罐问题，实现食品生产安全高效、低成本。
1.1 材料与试剂
山梨酸钾、苯甲酸钠（食品级），上海阿拉丁试剂有限公司；
孟加拉红琼脂培养基，广东环凯微生物科技有限公司；
核酸提取试剂及PCR试剂，Takara Bio公司。
1.2 仪器与设备
超净工作台，苏州净化设备有限公司；
生化培养箱，天津泰斯特仪器有限公司；
数显干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司；
电子天平，赛多利斯仪器系统有限公司；
移液器，德国Eppendorf；
PCR仪，美国ABI；
DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；
全自动凝胶成像系统，Bio-Rad公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株分离与纯化
采用梯度稀释法用无菌生理盐水对胀瓶样品进行10倍递增系列梯度稀释，各稀释度分别取1 mL样品匀液于2个无菌平皿内，加入25 mL 45 ℃孟加拉红琼脂培养基，混合均匀。同时，分别取1 mL无菌稀释液匀液于2个无菌平皿内作为空白对照。待培养基完全凝固后置于28 ℃培养2～5 d。取典型菌落编号为KS01并在分离培养基上进行划线纯化。
1.3.2 菌种鉴定
形态特征及理化实验鉴定参考《酵母菌的特征与鉴定手册》进行鉴定[10]。同时，采用通用引物NL1-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG和NL4-GGTCCGTGTTTCAAGACGG，扩增26S rRNA序列。PCR反应条件为预变性95 ℃ 5 min；
变性95 ℃1 min，退火52 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 80 s，共35个循环；
再延伸72 ℃ 5 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京华大基因科技有限公司进行序列测定。
1.3.3 不同防腐剂对酵母菌的控制研究
参考《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[11]中规定的添加量，分别配制含0 g·kg-1、0.05 g·kg-1、0.10 g·kg-1和 0.15 g·kg-1（4 个浓度组）苯甲酸钠及山梨酸钾的样品；
同时，用生理盐水将活化后的酵母菌菌株进行梯度稀释，制得菌悬液备用。无菌条件下，在含有不同浓度的苯甲酸钠和山梨酸钾的样品中加入酵母菌菌悬液，使酵母菌的初始浓度为1.5×103CFU·mL-1。每组样品3个平行，混匀后于28 ℃静置，在第0天、第3天、第7天和第28天分别进行菌落计数统计。以生理盐水为空白对照。
1.3.4 数据统计与分析
应用BLAST程序对所获得的测序结果进行同源性比较，并利用Clustal X及MEGA 6.0软件构建系统发育树；
应用Graph Pad 5.0进行进行数据统计及正交实验方差分析。
2.1 酵母菌的分离结果及形态特征
如图1A所示，KS01菌落在PDA培养基上呈乳白色，周围光滑，圆形，中央微隆起，边缘整齐，有明显光泽。菌落直径3～4 mm，黏稠，易于挑取，有芳香味。如图1B所示，其细胞呈卵圆形，大小为（3.0 ～ 7.5） μm×（1.5 ～ 3.0） μm（长 × 宽）。
图1 KS01菌落形态及细胞特征
2.2 酵母菌的鉴定结果
菌株KS01经NL1/NL4引物扩增所得26S rDNA序列长度大小为587 bp。利用BLAST软件将该序列在NCBI中已有的序列进行同源性比对，结果发现，菌株KS01与多株异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）的26S rDNA序列的同源性均在100%。利用MEGA 6.0构建系统发育图（图2），明确KS01与相关酵母菌之间的亲缘关系。结合形态鉴定结果和同源性比对及系统发育结果，可认定菌株KS01为异常威克汉姆酵母（W. anomalus）。
图2 菌株KS01系统发育树
2.3 常见防腐剂对酵母菌的控制研究
2.3.1 苯甲酸钠对酵母菌的控制研究
不同浓度的苯甲酸钠对异常威克汉姆酵母菌KS01的控制效果如图3所示。苯甲酸钠对KS01的抑制效果与处理浓度及时间呈正相关，相同处理时间点，样品中酵母菌菌体量随苯甲酸钠浓度的增加而呈逐渐下降趋势；
含相同浓度苯甲酸钠的样本中酵母菌菌体量随处理时间的延长呈现逐降低的趋势。因此，不同处理浓度的苯甲酸钠从处理第3天开始均对异常威克汉姆酵母具有显著且持续的抑制效果（P＜ 0.001）。
图3 苯甲酸钠对KS01的控制效果
2.3.2 山梨酸钾对酵母菌的控制研究
不同浓度的山梨酸钾对异常威克汉姆酵母菌KS01的控制效果如图4所示。山梨酸钾对异常威克汉姆酵母控制效果极显著（P＜0.01），其对异常威克汉姆酵母控制效果与处理浓度及时间呈正相关。处理3 d后，0.05 g·L-1山梨酸钾对KS01的控制效果极显著（P＜0.01），且随山梨酸钾浓度的增加，控制效果逐渐增强（P＜0.001）。同一处理时间，样品中酵母菌菌体量随山梨酸钾浓度的增加而呈下降趋势；
同一处理浓度中，随着处理时间的延长，样品中酵母菌菌体含量呈降低的趋势，静置28 d后，菌体含量不足20 CFU·mL-1，说明苯甲酸钠对异常威克汉姆酵母具有显著、持续的抑制效果。本研究中采用的两种防腐剂相比，山梨酸钾更安全，可保持食品原有的产品稳定性，可作为抑制异常威克汉姆酵母污染的首选防腐剂。
图4 山梨酸钾对KS01的控制效果
食品加工、贮运过程中由微生物引起的腐败变质一直是食品保鲜领域面临的世界性难题[12]。防腐剂可通过有效抑制食品中微生物的生长、繁殖，提升食品保存性，最终达到延长保存期和货架期的目的[13]。但随着食品工业的快速发展，传统的食品防腐剂已无法满足生产需求，因此选择有效、操作简便、低成本的防腐剂成为食品生产企业急需解决的关键问题。异常威克汉姆酵母（W. anomalus）属毕赤酵母，是食品生产各环节中普遍存在的酵母菌，也是饮料生产中常见的一种引起腐败的酵母菌[14-16]。郭冬琴等[6]从灭菌后胀瓶的橙汁中分离得到W. anomalus，与本研究所得结果一致。陆文俊等[17]也从蜂蜜中分离得到2株异常威克汉姆酵母，是蜂蜜中主要的腐败酵母菌，且具有较强的腐败能力。也有研究表明，毕赤酵母属也是导致葡萄酒和米酒发酵异常的原因之一[18-19]。因此，微生物的生长是导致食品腐败变质的根本原因，且不同微生物的致腐能力和特征不同。根据酵母菌的发生率和变质风险，可将食品饮料生产中发现的酵母菌划分为3个类别，异常威克汉姆酵母属于软饮料工厂生产中常见的第2类腐败酵母菌[20-21]。
防腐剂是食品生产过程中必不可少的添加剂。目前，我国使用的防腐剂主要是化学类食品防腐剂，其中酸性防腐剂如苯甲酸、山梨酸对酵母菌、霉菌及多数腐败菌均有抑制效果。已有的研究表明，苯甲酸钠主要通过干扰细胞代谢相关的酶活性抑制微生物细胞三羧酸循环，影响细胞代谢，阻碍细胞膜的通透性；
而山梨酸钾主要通过与巯基结合干扰细胞内多种酶系统，从而达到抑制微生物生长的目的[4]。二者都属于酸性防腐剂，在酸性环境下对微生物的抑制效果显著，这与本研究中产品性质一致，因此苯甲酸钠和山梨酸钾对异常威克汉姆酵母具有明显持续的抑制效果。苯甲酸钠和山梨酸钾属于酸性防腐剂，其抑菌效果主要取决于它们未解离的酸分子，抑菌效果随pH而定，酸性越大效果越好，而在碱性环境中几乎无效[22]。相同pH值下，苯甲酸的未解离度仅为山梨酸的1/3，其抑菌效力亦仅为山梨酸的1/3，因此山梨酸钾防腐效果比苯甲酸钠好[23]。此外，苯甲酸及其钠盐有叠加中毒现象，而山梨酸及其盐类抗菌力强，毒性小，是目前国际上公认的最好防腐剂，已被所有国家和地区允许使用[24]。另有研究表明饮料中富含氧气可促使异常威克汉姆酵母增殖，最终导致产品腐败[8,25]。因此，应及时对生产设备和产品进行酵母菌监测，从全方位确保产品质量。为不断提升产品的品质和安全性，天然防腐剂的选择和复配研究工作将是后续研究工作的重点。
从腐败饮料样本中分离获得一株乳白色酵母菌，将其命名为KS01。根据其菌落形态、细胞特征及26S rDNA序列分析结果，认定菌株KS01为异常威克汉姆酵母（W. anomalus）。因此，在新型饮料产品（如具有酸性、富氧、含糖等特征的饮料）的研发工作中需谨防因异常威克汉姆酵母污染导致的产品腐败变质。同时，污染酵母菌的控制研究结果表明，低剂量山梨酸钾和苯甲酸钠均对异常威克汉姆酵母具有显著且持续的抑制效果（P＜0.01）。其中，山梨酸钾在保持食品原有的产品稳定性的同时更安全，可作为抑制异常威克汉姆酵母污染的首选防腐剂，符合食品防腐剂应具有的低浓度下防腐效果好、性质稳定、成本低廉等特点，为防腐剂的选择和添加提供参考。
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