血小板光学检测技术对EDTA依赖性假性血小板减少的纠正性能分析
时间：2023-02-16 15:40:07 来源：千叶帆 本文已影响人
王利民 丁宁 臧思思 刘善凤 王平
在临床检验工作中，血常规标本镜下血小板聚集导致PLT计数假性减低是检验人员常遇到的问题。如何有效纠正这类标本的血小板计数，学者们[1-3]也进行了一系列研究，其中提到可采取的方法有重新采血、更换抗凝剂、添加阿米卡星、剧烈震荡等。另有研究报道[4]，迈瑞6、7系型号以上血液分析仪的光学法（PLT-O）对EDTA依赖性假性血小板减少（EDTA-PTCR）的标本具有解离作用。这种方法操作简单，可尽快发出检验报告且可避免患者再次采血，特别适用于门诊标本检验。但血液分析仪PLT-O对不同程度的EDTA-PTCP标本检测的血小板计数值与实际值究竟有无差别，能否直接用于检验报告的发放，是检验人员尤为关注的问题。本文针对这一问题进行研究报道分析。
1 对象 选取2020年4月～2021年5月我院门诊患者EDTA-PTCR 53例标本作为实验组，其中男性15例，女性38例，平均年龄为45±17岁；
另选取25例血常规检测镜下无血小板聚集的健康体检者作为对照组，其中男性7例，女性18例，平均年龄为44±16岁。
2 试剂和仪器 BC6800血液分析仪（深圳迈瑞）及配套标准品、质控品和试剂；
迈瑞SC-120自动血涂片制备仪、EDTA-K2抗凝真空采血管（武汉致远）、采血针、PLT稀释液（草酸铵法稀释液）、改良牛鲍氏计数板、CX显微镜（日本奥林巴斯）等。本实验室已通过ISO15189实验室认可，仪器性能验证达标，仪器性能符合检测要求。
3 方法 将确定为EDTA依赖性假性血小板减少的患者重新进行静脉采血，用EDTA-K2抗凝管采集血液2 mL放置20 min后（根据本实验室采血到上机检测的平均TAT时间），用迈瑞BC6800血液分析仪CDR模式进行检测，得到血小板电阻抗法（PLT-I）和PLT-O的检测值，并同时进行涂片染色镜检。血小板计数手工法（PLF-M）：静脉血采集前，提前准备好加有0.38 mL稀释液（草酸铵）的EP管、20 μL毛细采样管和棉球，EDTA-K2抗凝血采集后，立即挤出采血针管道内残留的血液，由检验人员吸取20 μL血液加入EP管内20倍稀释，混匀，整个采集过程在90 s内完成；
由两名资深的检验员采用双盲法严格按照《全国临床检验操作规程》[5]进行PLT计数，取两人两次计数的平均值记为PLT-M（两次计数的误差＜5%）。再根据EDTA-K2抗凝管标本随机计数每个标本镜下30个血小板聚集团（≥3颗的聚集团）的平均血小板数量又分成5组：PLT＜6颗、PLT 6颗～10颗、PLT 11颗～15颗、PLT 16颗～20颗、PLT＞20颗，以PLT-M值为靶值，CV≤2.5%（1/2美国CLIA，88能力验证计划的分析质量要求）作为判断纠正合格的标准，对标本的PLT-O值进行计数纠正的合格统计，对不合格标本进行观察分析。另随机选取10份纠正合格的标本，分别放置40 min、60 min后再统计仪器纠正计数合格数及涂片镜检。
4 统计学分析 计量资料采用平均值±标准差（）表示。应用SPSS 22.0软件，采用配对t检验进行组间比较分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。
1 对照组和实验组PLT-M、PLT-I及PLT-O结果 对照组PLT-I、PLT-O与PLT-M均无统计学差异（P＞0.05）。实验组PLT-I与PLT-M有统计学差异（P＜0.05），PLT-O与PLT-M无统计学差异（P=0.317），见表1。
表1 对照组和实验组PLT-M、PLT-I及PLT-O结果
25组不同血小板聚集数标本的直方图和血涂片 根据镜下随机计数30个血小板聚集团的平均血小板数量，将标本分成5组：PLT＜6颗、PLT 6颗～10颗、PLT 11颗～15颗、PLT16颗～20颗、PLT＞20颗。每组各选取一例血小板实际计数正常标本的血小板直方图及显微镜下图进行展示，如图1。从图中可以看出，随着血小板聚集颗粒数的增加，血小板直方图的波峰呈现下降趋势，尾部都存在翘尾现象。
图1 5组不同血小板聚集数标本的直方图和高倍镜（10×40倍）下血涂片
3 5 组标本的纠正计数统计 将53例标本的PLT-O检测值，以PLT-M值为靶值，CV≤12.5%为标准进行纠正计数合格统计，结果如表2。我们发现当PLT平均聚集颗粒数大于20颗时，PLT-O纠正计数的合格率很不理想。
表2 5组标本的纠正计数合格统计表
4 纠正合格标本和纠正失败标本血涂片对比 将PLT≤20颗PLT-O检测结果纠正失败标本的涂片与纠正合格标本的涂片油镜下进行对比，选取其中5份纠正失败标本和5份纠正合格标本的涂片，见图2。结果发现：PLT-O计数纠正合格的标本镜下血小板聚集较疏松，基本能看清各血小板的界限，而纠正失败的标本镜下血小板黏附聚集较致密，呈块状，各血小板之间的界限模糊或消失。
图2 5例纠正合格和5例纠正失败的标本血涂片油镜（10×100倍）下对比
5 另随机选取10份纠正合格的标本，分别放置40 min、60 min后再统计仪器纠正计数合格数量及涂片镜检。结果为：放置40 min后，纠正合格标本数为7份；
放置60 min后，纠正合格标本数为5份。纠正合格的标本镜下血小板平均聚集颗粒数仍小于20颗，而新增纠正失败的标本镜下血小板聚集的颗粒数出现了明显的增加，且平均颗粒数均大于20颗。
临床上导致血常规标本发生血小板聚集的主要原因有抗凝剂、血液采集因素、临床药物、冷凝集等。其中EDTA-PTCP是目前我们血常规检测中最常遇到的镜下血小板聚集案例。EDTA-PTCP如未及时发现，将为临床提供错误的检测结果，从而导致不必要的血小板输注、脾切除、皮质类固醇等不当治疗，可能会导致手术的延迟、不必要的骨髓穿刺等一系列错误的举措[6-9]，同时易引起医疗纠纷。因此准确识别EDTA-PTCP标本、及时有效地纠正血小板计数对临床决策很重要，这也是一名检验技师应该熟练掌握的技能。
本次研究选取了53例门诊EDTA-PTCP患者作为实验组和25例无血小板聚集的健康体检者作为对照组，本次实验标本选取静脉血，是为了避免静脉血和末梢血间血小板计数的误差[10]。结果表明：对照组PLT-I、PLT-O与PLT-M均无统计学差异（P＞0.05），表明手工法与仪器法具有一致性；
实验组PLT-I与PLT-M有统计学差异（P＜0.05），PLT-O与PLT-M无统计学差异（P=0.317），表明仪器检测EDTA-PTCP标本，PLT-I结果不准确，PLT-O结果具有较好的准确性，纠正计数性能显著。这是由于BC6800的PLT-O法对血小板具有解聚作用。BC 6800血液分析仪网织红细胞通道（RET通道）的PLT-O法对血小板的解聚主要是由四方面原因组成。首先保证最合适的解聚温度，试剂预热池和反应池的温度分别为45.47℃和42℃。仪器吸取血样后，立即与已经预热的荧光试剂一起高速注入42℃的恒温反应池中，形成旋流，使荧光试剂与血样充分作用。同时，搅拌杆以1400 r/min的速度对反应液进行高速搅拌，对血小板聚集的物理结构进行机械破坏。反应池通过涡旋混匀以及高速打散装置实现均匀分散血小板。另外试剂中的专属“解聚成分”对血小板聚集的分子结构进行化学破坏，并与单个血小板结合，使血小板依次通过激光检测通道，从而达到对血小板聚集结果的纠正。搅拌与加温都只是辅助的作用，这两者不会导致红细胞破坏。最后RET通道的PLT-O法采用核酸荧光染色，增强了对血小板形态的鉴别能力，可以有效地鉴别红细胞碎片，使得PLT检测结果不受红细胞碎片等物质的干扰[11]。
为了确定不同聚集程度的标本PLT-O检测值是否都能直接用于检验报告的发放，将随机计数30个血小板聚集团的颗粒数进行了分组，结果发现：PLT＜6颗、PLT 6颗～10颗、PLT 11颗～15颗、PLT16颗～20颗这四组的纠正计数合格率比较理想，均≥80%；
而PLT＞20颗的纠正计数合格率较差，只有22.2%，临床实验室不能接受。针对PLT≤20颗纠正计数失败的标本，油镜下仔细观察发现：与纠正计数合格的标本涂片相比，血小板与血小板之间黏附聚集更致密，呈块状，各血小板之间的界限模糊或消失。另外实验结果也表明随时间的推移，仪器解离纠正合格的标本数呈下降趋势。这是由于EDTA依赖性假性血小板减少会随时间的推移存在越来越严重的现象[12]。但只要标本解离时血小板聚集平均颗粒数小于20颗时，仪器仍具有良好的纠正性能。目前，EDTAPTCP发生的机制仍未能全面阐释。廖远泉等[13]总结了已发现的EDTA-PTCP发生机制，主要有EDTA的螯合机制（抗原抗体反应）、EDTA诱导血小板活化机制、“血小板的卫星现象”、温度相关性依赖现象-冷凝集、药物因素等，它的发生并不是某单一机制或因素影响所导致的现象，应是多种因素共同作用的结果。是否由于不同机制引发的EDTA-PTCP的聚集形式和程度的不同，从而导致部分标本无法解聚，有待进一步的研究。BAO等[14]引入“解聚率”概念来定义解聚效果，解聚率=血小板聚集标本PLT-O值/PLT真实值×100%，他认为EDTA-PTCP的解聚效果是由物理和化学因素的组合导致的解离效应。另外一些聚集严重的标本，血小板之间黏连非常严重，在此仪器的反应体系快速检测过程中无法打散所有聚集的血小板，许颖等[15]也进行了相应的报道。以上结果表明在PLT≤20颗且聚集较疏松的情况下，BC6800血液分析仪PLT-O计数可以直接用于检测结果值的发放；
但当血小板聚集颗粒数较多（＞20颗）或聚集较致密时， BC6800血液分析仪PLT-O通道并不能完全打散血小板聚集团，对血小板的纠正计数超过仪器检测血小板的允许误差，需采用其他纠正方法对血小板计数进行检测。
综上，检验工作中遇到EDTA依赖性假性血小板减少的标本可以使用BC6800血液分析仪光学法对血小板计数的进行纠正，但要结合血涂片镜下血小板聚集的大致颗粒数及血小板之间黏附的致密程度来确定纠正计数结果的准确性。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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