miR-140-3p,调节非小细胞肺癌细胞功能的研究*
时间：2023-02-16 18:55:08 来源：千叶帆 本文已影响人
朱 俊，乔平平，于晓霞，陈小燕，单倩倩***
（1 南通大学附属医院胸外科，南通226001，2 南通大学江苏省神经再生重点实验室；
3 南通大学附属医院放疗科）
肺癌是常见的恶性肿瘤之一，2020 年新增病例超过220 万[1]。其死亡率也极高，据报道[1]全球每年有近百万人死于肺癌。根据组织学类型和病理特征，肺癌可分为小细胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）。NSCLC 的死亡率高，治疗靶点有限，约占所有肺癌病例的85%[2]。近来，越来越多的研究[3-5]表明，NSCLC的发生及发展与许多遗传和表观遗传的改变有关。例如，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的突变与NSCLC 的进展和转移有关，因此针对抑制EGFR 酪氨酸激酶的治疗取得了一定的临床效果[6]。除编码基因外，大量非编码基因，特别是microRNAs（miRNAs）在NSCLC 中表达模式亦发生显著改变，并在NSCLC 的发生和发展过程中发挥重要作用[7-8]。
miRNA 是一组内源性单链非编码RNA 分子，长度约为22 个核苷酸，参与调节多种细胞过程，如代谢、凋亡、增殖、分化，并参与正常的生理功能。相反，调节异常的miRNA 与许多人类疾病有关，包括遗传疾病、神经系统疾病和癌症[9-11]。前期研究[12-13]发现，NSCLC 组织中大量miRNA 的表达发生了显著改变，并与肺癌患者的生存率密切相关。因此，探索NSCLC中差异表达miRNA 的生物学功能，可为NSCLC 诊断和治疗的转化应用提供潜在的分子依据。
研究[14-15]表明，miR-140-3p 在NSCLC 的一种亚型肺鳞癌患者中表达下调，并确定其作为肺癌的潜在生物标志物。本研究拟用miR-140-3p mimic 或inhibitor 转染NSCLC 细胞，检测转染细胞的增殖率和迁移能力，评价miR-140-3p 对NSCLC 的生物学效应，并进一步分析miR-140-3p 的潜在靶基因及其生物学意义。
1.1 NSCLC 细胞株培养和转染 人NSCLC 细胞株A549（目录号：GCC-LU0003RT/GCC-LU0003CS）和NCIH1299（目录号：GCC-LU0005RT/GCC-LU0005CS）购自上海基因科技股份有限公司。将细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，A549 细胞使用DMEM-F12培养基（含10%胎牛血清，1%青霉素和1%链霉素）培养，NCI-H1299 细胞使用DMEM 培养基（含10%胎牛血清，1%青霉素和1%链霉素）培养，每隔1 d 更换细胞培养基。使用Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂（Invitrogen 公司）在A549 和NCI-H1299 细胞中，分别转染miR-140-3p mimic、mimic 对照、miR-140-3p inhibitor 或inhibitor 对照（广州RiboBio 公司）。
1.2 实时定量反转录聚合酶链式反应（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）为了确定miR-140-3p 及下游靶基因的表达，提取细胞总RNA，使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒和stemloop RT 引物（Ribobio），或HiScript Ⅲ逆转录试剂盒和oligo-dT 引物（Vazyme）逆转录1 μg 的RNA，采用StepOne Real-time PCR 系统（Applied Biosystems）检测miR-140-3p 及靶基因的表达水平。miR-140-3p Bulgle-loop miRNA qRT-PCR引物组（每组1 条RT 引物，1 对qPCR 引物）由Ribo-Bio 设计。靶基因引物采用Primer 5 软件设计，由上海生工合成，引物序列见表1。miR-140-3p 的相对表达水平用U6 作内参，靶基因的相对表达水平使用GAPDH 作内参，使用2-ΔΔCt方法计算。
表1 靶基因引物序列
1.3 EdU 增殖检测 A549 和NCI-H1299 细胞转染miR-140-3p mimic、mimic 对 照、miR-140-3p inhibitor 或inhibitor 对照后，用Cell-light EdU DNA 细胞增殖试剂盒（RiboBio）检测细胞的增殖状态，50 μmol/L EdU 处理2 h 后，再用Hoechst 33342 复染标记所有的细胞。使用Leica DMR 荧光显微镜拍摄细胞显微图片，统计EdU 阳性细胞数和总细胞数，最后测定细胞增殖率，计算公式：细胞增殖率/%=EdU 阳性细胞数/总细胞数。
1.4 Transwell 迁移分析 分别将转染miR-140-3p mimic、mimic 对照、miR-140-3p inhibitor 或inhibitor对照的A549 和NCI-H1299 细胞悬浮在不含血清的培养基中，然后将细胞悬液添加到直径6.5 mm、孔径8 μm 的Transwell 室的上腔室中，使细胞向含血清培养基的底部腔室迁移，培养36 h 后去除上腔残留细胞，固定上腔底面的细胞，0.1%结晶紫染色。在Leica DMR 倒置显微镜下拍摄细胞显微照片，观察结晶紫染色区域，检测细胞的纵向迁移能力。
1.5 划痕实验 将转染了miR-140-3p mimic、mimic对照、miR-140-3p inhibitor 或inhibitor 对照的A549和NCI-H1299 细胞，分别接种到带有插片的培养模具中，插片宽1 mm，待细胞融合达到95%时去除插片，融合处留下1 mm 宽的缺口，继续培养10 h，在Leica DMR 倒置显微镜下拍照，检测缺口闭合情况。使用Image-Pro Plus 计算清洁区域面积，以确定细胞的横向迁移能力。
1.6 miR-140-3p 的生物信息学分析 利用靶基因预测软件miRWalk、RNA22、TargetScan 以及miRDB联合预测miR-140-3p 的潜在靶基因；
使用Cytoscape软件，通过DisGeNet 工具检索NSCLC 相关基因[16]；
然后，借助维恩图工具（Venny 2.1.0；
http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），将几种工具筛选到的基因取交集；
最后，对相关基因进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。
1.7 统计学方法 所有数据均来自3 次重复实验，定量数据以表示。使用GraphPad Prism 6.0 软件进行统计分析和图表绘制，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 miR-140-3p 促进NSCLC 细胞的增殖 qRTPCR 结果显示，转染miR-140-3p mimic 的A549 细胞中，miR-140-3p 的表达丰度显著高于对照组，而转染miR-140-3p inhibitor 的A549 细胞中，miR-140-3p 的表达丰度显著低于对照组（图1A），表明在A549 细胞中，转染miR-140-3p mimic 或inhibitor分别增加或降低了miR-140-3p 的表达。然后，对转染的A549 细胞进行EdU 增殖检测，观察miR-140-3p 表达的改变是否会影响细胞增殖。EdU 染色结果显示，miR-140-3p mimic 转染后，处于增殖状态的A549 细胞数量明显增加，统计结果显示，转染miR-140-3p mimic 的A549 细胞中，EdU 阳性细胞占总细胞的比率是对照组的1.5 倍以上。相反，转染miR-140-3p inhibitor 则导致EdU 阳性细胞的数量和比率降低（图2A，见封二）。
图1 转染A549 或NCI-H1299 细胞后miR-140-3p 的表达水平
图2 miR-140-3p 促进NSCLC 细胞增殖
另一种NSCLC 细胞，NCI-H1299 细胞，亦成功转染了miR-140-3p mimic 和inhibitor（图1B）。与A549 细胞观察结果相似，转染miR-140-3p mimic的NCI-H1299 细胞增殖率升高，而转染miR-140-3p inhibitor 的NCI-H1299 细胞增殖率则降低（图2B，见封二）。这些结果提示miR-140-3p 可以促进NSCLC 细胞的增殖。
2.2 miR-140-3p 抑制NSCLC 细胞的迁移 Transwell 实验显示，A549 细胞可以从上腔室表面迁移至含血清的下腔室。然而，miR-140-3p mimic 转染后，与对照组相比，迁移的细胞减少到50%以下；
而miR-140-3p inhibitor 转染后，与对照组相比，迁移的细胞增加到3.5 倍以上（图3A，见封二）。相应地，miR-140-3p mimic 或inhibitor 转染NCI-H1299 细胞后，获得了相似的结果，细胞迁移亦明显减少或增加（图3B，见封二）。
图3 miR-140-3p 抑制NSCLC 细胞的迁移
随后，通过划痕实验观察miR-140-3p 对A549和NCI-H1299 细胞伤口愈合的影响。结果显示，插片从细胞培养模室中取出后，各组产生了等宽的创面，在A549 细胞中，去除插片10 h 后，与对照组相比，miR-140-3p mimic 转染后留下了更大的清洁区域。相比之下，miR-140-3p inhibitor 转染后与对照相比，清洁区域明显减小（图4A、C，见封二）。类似的，转染miR-140-3p mimic 的NCI-H1299 细胞相对清洁区域比对照组大，转染miR-140-3p inhibitor 的NCI-H1299 细胞相对清洁区域则明显减小（图4B、D，见封二）。这些结果表明miR-140-3p 抑制了NSCLC细胞的迁移。
图4 miR-140-3p 抑制NSCLC 细胞的创面愈合
2.3 miR-140-3p 下游靶基因及相关生物信息学分析 鉴于miRNA 通过抑制靶基因的表达参与机体病理生理调控的作用机制，利用生物信息学工具预测了miR-140-3p 的潜在靶基因。miRWalk、RNA22、TargetScan 和miRDB 软件分别筛选了11 385、3 464、1 028 和697 个mRNA 作为miR-140-3p 的候选靶基因，利用维恩图将筛选到的候选靶基因取交集，得到62 个共同靶基因（图5A）。进一步将这62 个靶基因与Cytoscape 软件检测的NSCLC 相关基因取交集，结果发现PDPK1（3-phosphoinositide dependent protein kinase 1）、INO80D（INO80 complex subunit D）、HGF、CDK6（cyclin dependent kinase 6）、NDC1（NDC1 transmembrane nucleoporin）、E2F7（E2F transcription factor 7）、BACE1（beta-site APP cleaving enzyme 1）、CBL、EZH1（enhancer of zeste homolog1）、HOXB5（homeo box B5）、HBP1、OTUD7B、CD274（CD274 molecule）、ADAM10（ADAM metallopeptidase domain 10）、TCF4（transcription factor 4）、SKIL（SKI-like proto-oncogene）共16 个基因存在重叠（图5B～C）。接着，从这16 个潜在的靶基因中挑选已被证实[17-20]对细胞增殖有抑制作用的CBL、HBP1、HGF 及OTUD7B 共4 个基因进行qRT-PCR 验证，结果发现当加入miR-140-3p mimic 时，CBL 的表达水平被明显抑制，而miR-140-3p inhibitor 则显著提升了CBL 的表达，提示CBL 基因可能是miR-140-3p 在NSCLC 中发挥作用的潜在靶点（图5D）。
图5 miR-140-3p 潜在靶基因的预测
利用Cytoscape 软件对潜在靶基因及密切相关的GO 和KEGG 通路进行基因调控网络分析，构建并展示基因的相互作用网络及其生物学意义。其中INO80D、E2F7、HOXB5、HBP1 和OTUD7B 在GO 或KEGG 通路中均未富集到，因此未在调控网络中展示。基因调控网络分析结果显示，这些潜在靶基因参与的生物学功能主要分为磷酸肌酸-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信号通路的正向调控、细胞对转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）刺激应答的负调控、通过死亡域受体的外部凋亡信号通路、氧化应激反应中的细胞死亡、毒素运输、膜蛋白外域蛋白水解、黑色素瘤和慢性髓系白血病等（图6，见封二）。
图6 Cytoscape 软件构建miR-140-3p 潜在靶基因参与的基因网络调控图
miRNA 异常表达可能参与调节NSCLC 细胞的功能，进而影响NSCLC 疾病的严重程度。在本研究中，检测了miR-140-3p 对A549 和NCI-H1299 两种NSCLC 细胞株的调控作用，发现miR-140-3p 能够促进NSCLC 细胞的增殖，抑制NSCLC 细胞的迁移。
miR-140-3p 的生物学功能已经在多种不同的细胞类型中进行了研究。外周血单核细胞中miR-140-3p 表达被抑制后，可导致细胞增殖减少、凋亡升高、分化抑制[21]。有报道称miR-140-3p mimic 在动脉平滑肌细胞[22]和食管鳞癌细胞[23]中抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。此前，有研究[24-25]报道了miR-140-3p 对NSCLC 细胞的影响，发现miR-140-3p mimic 转染后，细胞活力和迁移受到抑制。本研究将miR-140-3p mimic 或inhibitor 分别转染NSCLC 细胞，旨在获得更全面的观察结果。实验数据显示，miR-140-3p mimic 和inhibitor 对NSCLC 细胞行为产生了相反的影响，结果进一步证实miR-140-3p促进了NSCLC 细胞的增殖率，但抑制了NSCLC 细胞的迁移能力。
本实验中，细胞增殖的检测结果与之前报道的不一致，因为miR-140-3p 的下游靶基因较多，推测这可能与不同细胞中miR-140-3p 作用的靶基因不同有关。CBL 是细胞增殖的抑制分子，已有报道[17]miR-940 通过抑制CBL 的表达促进胃癌细胞的增殖，本研究的检测结果显示过表达miR-140-3p 显著抑制了CBL 的表达，而miR-140-3p 的表达被抑制后，CBL 的表达水平则显著提升，提示CBL 有可能是miR-140-3p 发挥效应的靶点，这还有待于进一步的实验验证。除了对细胞增殖的影响，本实验数据与之前的观察一致，均显示miR-140-3p 抑制了NSCLC 细胞的迁移能力。对miR-140-3p 潜在靶基因的功能注释显示，miR-140-3p 及其靶基因，特别是PDPK1 和SKIL，与细胞对TGF-β 刺激应答负调控的生物学过程紧密相关。有报道称miR-140-3p 是TGF-β3（TGF-β 家族成员）的直接上游调控因子[26]，TGF-β 的过度表达和（或）激活可以增加NSCLC 细胞的活力和迁移能力[27]。因此，在NSCLC 中下调miR-140-3p 可能导致TGF-β 信号通路升高，提高NSCLC的生存能力和迁移能力。此外，TGF-β 也被认为是上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程中重要的诱导因子[28]，EMT 程序在癌症中被激活后，与癌细胞的浸润和转移密切相关[29]。因此，miR-140-3p 也有可能通过影响EMT 过程，进而参与NSCLC 的发生与发展。
综上所述，通过联合使用miR-140-3p mimic 和inhibitor，综合评价了过表达或抑制miR-140-3p 对NSCLC 细胞功能的影响，发现miR-140-3p 可以促进NSCLC 细胞的增殖，抑制其迁移能力，实验结果有助于更全面地理解miR-140-3p 对NSCLC 细胞行为的调控，为进一步深入研究miR-140-3p 对NSCLC 细胞的作用机制提供实验依据。
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