脓毒症老年大鼠早期心功能变化
时间：2023-02-18 12:50:05 来源：千叶帆 本文已影响人
莫为春，陈俊峰，郭朋，赵鑫，王苛苛，杨斐宇，申捷，张志华
1.上海市复旦大学化学伤害与急危重病研究中心＆上海市卫生健康委员会化学伤害急危重病医学重点实验室＆复旦大学附属金山医院急危重病中心，上海 200540；
2.复旦大学附属金山医院心超室，上海 200540
脓毒症是感染引起宿主自身的复杂异常反应，造成具有生命危险的器官功能障碍［1］，为全世界重症监护室里患者的主要死亡原因之一［2］。脓毒症可以导致多种器官功能损害，最常见的有肺脏、肾脏、肝脏、心脏等。随着目前老龄社会的到来，老年患者明显增多，老年患者因为器官功能的减弱，更容易发生脓毒血症及多脏器功能衰竭。脓毒症心肌病早有报道过，Pulido 等［3］报道脓毒症心肌病发病率达64%，脓毒症患者伴有心肌功能障碍更容易死亡。心功能障碍是脓毒症诱导的多器官功能衰竭的一个严重组成部分，与较高的死亡率相关［4⁃5］。脓毒症导致的心肌功能损害，包括可逆性左心室收缩功能失调，左心室扩大等，随着研究的深入，发现不仅存在左心室收缩功能失调而且存在左心室舒张功能失调、右心室功能失调，甚至弥漫性心肌功能失调［6］。但是对于老年患者脓毒症导致心肌功能损害出现的时间，相关研究极少。本研究通过脓毒症老年大鼠炎症因子，常规心脏超声检查结果及血心肌酶联合阐述脓毒症老年大鼠早期心脏功能的变化。
1.1 实验材料
1.1.1 动物SPF 级同遗传背景SD 老年雌性大鼠24 只，12月龄，体质量（180 ±10）g，上海市计划生育科学研究所实验动物经营部提供（动物生产许可证号：SCXK（沪）2018⁃0006，动物质量合格证编号：20180006022419）。大鼠饲养条件：自由饮食与饮水，室内温度22～24 ℃，室内湿度50%～60%，保持饲养环境安静，噪音小于80 分贝，保持饲养环境清洁。实验经伦理委员会批准，实验动物符合3R 原则。
1.1.2 主要仪器与试剂台式高速冷冻离心机，上海托莫斯科学仪器有限公司，型号：
1⁃16R；
－80 ℃医用低温保存箱，青岛海尔股份有限公司，型号：Haier DW⁃86L338J；
多功能酶标仪，瑞士Tecan（帝肯），型号：Infinite M1000 Pro；
试剂：Lactate dehydrogenase as⁃say kit，南京建成，货号：
A020⁃2⁃1；
试剂：
Rat Creatine kinase MB isoenzyme Assay Kit，南京建成，货号：
H197⁃1⁃1；
试剂：
Rat TroponinⅠAssay Kit，南京建成，货号：H149⁃1⁃1；
试剂：
Rat Myoglobin Assay Kit，南京建成，货号：
H150⁃1⁃1。
1.2 方法
1.2.1 老年大鼠脓毒症模型建立脓毒症老年大鼠模型通过盲肠结扎穿孔术（Cecal Ligation Perfora⁃tion，CLP）建立，使用戊巴比妥钠（20 mg／kg，腹膜内）麻醉，采用随机数字表将大鼠分为正常对照组、假手术组、手术1 h 组、手术3 h 组，每组6 只。手术1 h 组，手术3 h 组大鼠均予以盲肠结扎穿孔，建立脓毒症模型；
穿孔后，观察大鼠出现精神萎靡，活动减少，对于刺激的反应减弱，说明造模成功。具体过程如下：
（1）麻醉的大鼠被固定在手术操作台，将大鼠的腹部进行备皮，充分暴露大鼠腹部皮肤，通过酒精对手术范围进行完全消毒。（2）手术区域完成消毒后，将无菌洞巾覆盖于腹部正中切口区域。（3）使用手术刀作一纵向切口（约3 cm）于腹部正中线，逐层切开并钝性分离皮肤，筋膜，肌肉。固定皮肤与肌肉，暴露手术区域。（4）用止血钳在腹腔左下腹寻找盲肠，提出腹腔内盲肠，减少过多肠管在空气中暴露，同时将暴露于空气中的肠管用湿纱布覆盖，避免肠管因脱水造成肠坏死。（5）将盲肠内残余粪便推入盲肠顶端。（6）自盲肠的顶端向下，利用21 号针头进行贯通穿刺，穿刺过程中，避免损伤肠壁血管。同时确保穿刺后能排出少量粪便，穿刺部位的粪便通过生理盐水进行清洗。（7）在1／2 处盲肠通过4 号缝合线结扎，避免结扎太紧造成组织损伤，避免太松不能使盲肠内粪便进入腹腔。（8）4 号缝合线逐层缝合腹部肌肉、筋膜、皮肤，关腹后，碘伏消毒伤口。（9）手术操作完成后，将大鼠置于22 ℃恒温笼具内，保持充足食物及水。（10）假手术组同样予以开腹、暴露盲肠、关腹等操作，但不进行盲肠穿刺与结扎。
整个手术过程在10 min 内完成，严格遵循手术过程中的无菌原则，避免因人为因素导致的感染，影响实验结果。
1.2.2 心脏超声采集操作台上固定大鼠四肢，胸部脱毛，使用GE⁃Vivid E95 超声诊断仪，探头L8⁃18⁃D，超声探头接触部位涂抹超声耦合剂，对大鼠进行左室长轴M 型超声，常规多普勒血流速度、组织多普勒超声检查。观察指标包括左心室收缩末期及舒张末期的内径和容积、左心室EF、左心室短轴缩短分数、舒张早期二尖瓣血流速度E 峰值、舒张晚期二尖瓣血流速度A 峰、 E／A 比值等。按照美国超声心动图协会推荐方法进行所有数据的检测与计算，每组数据均为3 个连续心动周期的平均值。见图1和图2。
图1 老年大鼠四腔心切面
图2 老年大鼠左室长轴切面
1.2.3 血清标本采集及储存心脏超声测定完成后立即由1 mL 注射器（0.45 mm）经腹主动脉采血1.0 mL 于真空采血管中（EDTA K2，2.0 mg／mL）／（分离胶-促凝剂）。于4 ℃环境下直立静置2 h 后，离心机4 ℃，4 000 r／分钟离心5 min，取上层血清于离心管，－80 ℃冻存留待后续检测。
1.2.4 ELISA 测定细胞因子及心肌酶谱检测取－80 ℃冻存血清样本，4 ℃自然融解，根据试剂盒说明书，通过ELISA 法对以下指标进行检测。（1）细胞因子：肿瘤坏死因子α （TNF⁃α）、转化生长因子β（TGF⁃β）、白细胞介素1β （IL⁃1β）、白细胞介素6 （IL⁃6）、白细胞介素8 （IL⁃8）及白细胞介素10 （IL⁃10）；
（2）心肌酶谱：心肌肌钙蛋白Ⅰ（TNI），肌酸激酶同工酶（CK⁃MB），肌酸激酶（CK）及乳酸脱氢酶（LDH）。
1.3 统计学分析
采用SPSS 22.0 统计软件对实验数据进行统计学分析。计量资料数据服从正态分布，以均数±标准差（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD⁃t 检验，不齐采用Tamhane"st检验进行两两比较。非正态分布采用Kruskai⁃Wallis 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 一般行为
正常对照组老年大鼠活动力强，对于刺激反应灵敏。脓毒症组老年大鼠对于刺激反应减弱，活动力减弱，眼角出现分泌物增多以及抽搐的症状。
2.2 脓毒症老年大鼠炎症因子变化
手术3 h 组炎症因子TNF⁃α、 TGF⁃β、 IL⁃10、 IL⁃1β、 IL⁃8 较正常对照组与假手术组均升高（P＜0.05）。手术3 h 组的IL⁃8 较手术1 h 组升高（P＜0.05）。手术1 h 组的IL⁃10、 TNF⁃α 较正常对照组与假手术组均升高（P＜0.05）。手术1 h 组的TGF⁃β 较正常对照组升高（P＜0.05）。见表1。
表1 脓毒症老年大鼠炎症因子变化
2.3 脓毒症老年大鼠心肌酶变化
手术3 h 组较手术1 h 组，TNI、CK⁃MB、CK 均有所升高。但与正常对照组与假手术组差异无统计学意义。见表2。
表2 脓毒症老年大鼠心肌酶变化
2.4 脓毒症老年大鼠心脏超声变化
手术3 h 组LVEDs，较对照组、假手术组、手术1 h组升高（P＜0.05）；
手术3 h 组LVEF，较对照组、假手术组、手术1 h 组降低（P＜0.05）；
手术3 h 组LVFS，较对照组、假手术组、手术1 h 组降低（P＜0.05）；
手术3 h 组ESV，较对照组、假手术组、手术1 h 组升高（P＜0.05）；
其余超声指标各组之间差异无统计学意义。见表3。
表3 脓毒症老年大鼠心脏超声指数变化
脓毒症是ICU 患者的主要死亡原因之一［2］，心功能障碍是与这种危重疾病息息相关的多器官功能衰竭中的重要组成部分［7］。从2002年发起拯救脓毒症的倡议后，脓毒症治疗指南建议6 h 与24 h bun⁃dle 集束化治疗策略，2012年修改为3 h 与6 h bun⁃dle 集束化治疗策略，到2018年的1 h bundle 集束化治疗策略，这是对脓毒症的不断认识与理解做出的不断更新。目前脓毒症的病死率较前有所下降，但是脓毒症的发病率没有降低，尤其老年患者［8⁃9］。脓毒性心肌病明显增加脓毒症患者的病死率。随着床旁心脏超声的广泛应用，对脓毒性心肌病的认识越来越深入，从以往认为可逆性的左心室收缩功能受损及左心室扩大到目前的左心室收缩与舒张功能受损、右心室功能受损，甚至弥漫性心肌功能受损［6］。但是老年脓毒症患者心肌功能损害发生的时间目前没有相关研究。
本研究通过建立脓毒症老年大鼠模型，观察脓毒症发生的早期，血清炎症因子、心肌酶、心脏超声指标的变化。通过研究发现，手术1 h 组，部分炎症因子包括TNF⁃α、 TGF⁃β、 IL⁃10 已经开始升高，其中TNF⁃α、 IL⁃10 较正常对照组与假手术组差异均有统计学意义（P＜0.05），TGF⁃β 较正常对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。手术3 h 组，大部分炎症因子包括TNF⁃α、 TGF⁃β、 IL⁃10、 IL⁃1β、 IL⁃8 较正常对照组与假手术组均升高（P＜0.05），其中手术3 h组IL⁃8 较手术1 h组进一步升高（P＜0.05）。感染发生后，炎症因子释放促进了机体炎症反应的发生，发挥主 要 作 用 的 炎 症 因 子 包 括TNF⁃α、 IL⁃6、 IL⁃8、TGF⁃β、 IL⁃10、 IL⁃1β 等。TNF⁃α 是炎症发生发展过程中最重要的炎症因子，可以促使其他的炎症因子合成与释放。IL⁃8 能刺激中性粒细胞与T 淋巴细胞的趋化，使内皮细胞损伤，微循环的血流淤滞与组织坏死，最终损害器官功能。其他炎症因子包括TGF⁃β、 IL⁃10、 IL⁃1β、 IL⁃6 均参与炎症反应，与炎症的发展密切相关。炎症介质“瀑布样释放”，导致炎症反应进一步加重，以及器官功能损害。假手术组与正常对照组的炎症因子差异无统计学意义，说明上述炎症因子的释放与手术本身无关；
手术1 h 组部分炎症因子开始升高，说明炎症反应已经开始，手术3 h组大部分炎症因子均已升高，并且与正常对照组与假手术组存在差异，提示炎症因子升高与感染发生有关，并在感染后早期即可出现。
“瀑布样释放”的炎症因子，打破了促炎反应与抗炎反应之间的平衡，造成器官功能损害，包括心脏功能。本研究发现，手术1 h 组大鼠的各心脏超声指标较对照组与假手术组无变化。手术3 h 组部分心脏超声指标有变化，包括3 h LVEF，3 h LVFS 较对照组、假手术组、手术1 h 组降低；
3 h 左心室收缩末期内径（Left ventricular end⁃systolic dimension，LVEDs）及3 h收缩末期容积（End⁃systolic volume，ESV）较对照组、假手术组、手术1 h 组扩大，左心室舒张末期内径与容积无变化，符合脓毒性心肌病的特点。本研究的结果提示在脓毒症早期3 h 的时候，左心室已存在收缩功能的损害，而同时检测的手术1 h 组与3 h 组心肌酶TNI、 CK、 CK⁃MB、 LDH 与正常对照组、假手术组均无变化，提示心肌功能的早期异常可能更多地与炎症反应相关，而此时的心肌细胞尚未坏死，心肌酶未大量释放。
脓毒症早期，病原微生物与脂多糖结合蛋白结合，形成免疫复合物，再与单核细胞、巨噬细胞表面的Toll 样受体结合，这些细胞形成并释放诸多炎症因子。大量炎症反应因子打破了促炎反应与抗炎反应的平衡，同时免疫反应调节失控，血管内皮功能障碍，内皮细胞损伤以及线粒体功能受损，导致早期的脏器功能障碍，包括早期的心脏功能障碍。目前认为还有非正常的新陈代谢与受损的肾上腺素能反应也是潜在的驱动力［10］。脓毒症导致线粒体的结构与功能受到损害，能量供应不足，导致线粒体来源的损伤相关分子模式（DAMPs）的过度生产，如活性氧物质（mtROS）、线粒体DNA 片段（mtDNA）、 n⁃甲酰基肽、心磷脂、 ATP、线粒体转录因子A 和细胞色素c［11］。在脓毒症中，这些分子加剧心肌炎症与继发性心肌病的发生发展［12］。
总之，脓毒症老年大鼠早期（3 h 内）已经出现明显的炎症反应，伴有心脏功能障碍，主要表现为左心室收缩功能减弱，左心室收缩末期内径与容积扩大，而左心室舒张末期内径与容积无变化，此时的心肌酶并无变化，提示在脓毒症早期运用超声心动图监测心功能改变对脓毒性心肌病的早期诊断和及时干预具有重要的临床价值。脓毒症早期心脏功能障碍的发生机制可能与炎症因子、免疫系统失控、血管内皮功能受损、氧化应激与细菌毒素致线粒体功能障碍相关。
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