免疫球蛋白调控动物胃肠道健康及微生物功能的研究进展
时间：2023-02-19 08:45:06 来源：千叶帆 本文已影响人
卜 莹，郑 楠，王加启，赵圣国
(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)
动物胃肠道直接与外界相通，被视为抵御外界病原体的一道重要屏障，因此，动物机体健康与胃肠道健康紧密相关。健康动物可以产出更高质量的动物产品，为畜牧生产带来更高的经济效益。胃肠道健康水平可反映动物机体的健康程度，微生物的功能和种类组成影响着胃肠道的稳态平衡。微生物群通过定植在胃肠道黏膜，在黏膜免疫系统发育中起着至关重要的作用，且对宿主的免疫和健康水平也起着重要作用[1]。反刍动物的胃肠道微生物通过发酵作用产生挥发性脂肪酸(volatile fatty acids,VFAs)和微生物蛋白(microbial proteins,MCPs)[2]，为机体提供优质氮源和能量，其中能量供应占机体需求的70%[3]。
目前，对胃肠道内微生物群落调控的方式有很多种，如益生菌(乳酸菌类、芽孢杆菌类、酵母类等)和益生元(低聚果糖、纤维素、果胶等)。益生菌制剂作为一种饲料添加剂，常被用于改善肠道微生态平衡[4]。此外，益生菌代谢产生的过氧化氢和细菌素等也可抑制潜在的病原菌[5]。但由于胃肠道菌群组成的不确定性以及胃肠道内外环境不稳定性等原因，使其推广应用受到一定的限制。因此，需要一种方法去调控动物胃肠道微生物，从而调控胃肠道功能和健康，且该方法需对动物机体的正面影响最小化和高效化。
免疫调节是一种高效且相对安全的调节方式。免疫球蛋白进入胃肠道内能够对相应的病原或细菌起到抑制作用[6]。近年来，免疫球蛋白常被用于调控动物机体健康、胃肠道功能代谢，以及维护胃肠道健康。作者就现阶段免疫球蛋白对胃肠道功能调节的研究进展进行综述，以期为应用免疫球蛋白调控动物胃肠道健康和促进营养代谢提供指导。
动物体内的免疫球蛋白根据理化性质和生物学功能可以分为多种，主要有IgG、IgM、IgE、IgA、IgY及纳米抗体(VHH)等，由于IgM产量少、失效短，IgE含量极低，不易测得，因此对这2种免疫球蛋白没有进行介绍，主要介绍了以下4种，其结构图见图1。
1.1 IgG
IgG的分子质量为150 ku，具有较长的血清半衰期，因此在免疫球蛋白介导的防御机制中起着重要的作用[7]。IgG在免疫反应中起直接作用，主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞产生，IgG免疫性高，在体内广泛分布，其被巨噬细胞吞噬后具有中和抗原的功能[8]。人IgG分为4个亚类，分别为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；
牛IgG主要有2个亚类，分别为IgG1和IgG2。
1.2 IgA
IgA主要分布于黏膜表面，如呼吸道、泌尿道、肠道、乳腺和皮肤[9]。IgA的分子质量为160 ku，存在2个亚类：IgA1和IgA2，前者是在血清中发现的主要亚类，后者在分泌物中的含量高于血清。IgA在黏膜表面起保护作用，一般血清中IgA浓度低于IgG浓度。分泌性IgA(sIgA)通过中和作用或阻止黏膜表面附着来保护黏膜表面免受细菌、病毒和毒素侵害[10]。sIgA是由2个IgA单体(每个单体含2条轻链和2条重链)、1条J链和1条分泌片构成的异源十聚体，是唾液中的重要成分，占总免疫球蛋白的85%以上[11]，西门塔尔牛唾液IgA浓度约为0.56 mg/mL[12]。
1.3 IgY
IgY的分子质量为180 ku，由2条重链(H)和1条轻链(L)组成。IgY在被动免疫中起重要作用，是在禽类中发现的主要免疫球蛋白，卵黄中含有大量IgY (8～25 mg/mL)，IgY与IgG有相似的生物功能[13]。IgY被广泛应用于免疫检测、免疫组化、诊断等领域[14]，被认为是一种很有前途的调节微生物群的工具[15]。
1.4 VHH
VHH是一种存在于骆驼科及鲨鱼科动物外周血液且天然缺失轻链的免疫球蛋白，分子质量为15 ku，该抗体只含有1个重链可变区和2个常规的CH2和CH3区，与常规免疫球蛋白相比，相当于典型免疫球蛋白的重链可变区[16]。VHH是目前已知的可结合目标抗原的最小单位，晶体长4.8 nm，宽2.5 nm[17]，具有稳定性好、开发周期短、特异性强、亲和力高等特点，常用于医疗研究，如疫苗。研究发现，可以通过构建VHH基因库，从而筛选出含目的基因的VHH，再利用该VHH代替之前的传统免疫球蛋白，对疫苗的研发和动物疾病的防御具有重要作用[18]。
图1 IgY(A)、IgG(B)、sIgA(C)及纳米抗体(D)的结构图[19-21]Fig.1 Structure of IgY(A),IgG(B),sIgA(C) and nanobodies(D)[19-21]
2.1 抑制甲烷排放
瘤胃内的微生物菌群代谢时会产生气体，如甲烷、CO2等，其中甲烷是反刍动物正常消化代谢的产物，由瘤胃内产甲烷菌利用产生的CO2和H2生成。反刍动物瘤胃内甲烷的排放是一种能量损失，同时也增强了大气的温室效应。因此，减少瘤胃内甲烷的生成对提高饲料能量利用率和碳减排具有重要意义[22]。瘤胃产甲烷菌在甲烷杆菌目中分为3个主要属：甲烷短杆菌属、甲烷菌属和甲烷菌属。甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)是瘤胃的优势产甲烷菌属，用16S rRNA对瘤胃样本进行测序，结果表明有超过50%的基因序列都来自于甲烷短杆菌[23]。人们通过给动物接种特异性甲烷菌疫苗，刺激免疫系统产生抗体，使得产甲烷菌的功能与其产生甲烷的能力受到限制。Zhang等[24]利用产甲烷短杆菌M1膜蛋白EhaF制备疫苗免疫山羊，结果表明，疫苗接种组血清和唾液滴度为320 000和440，显著高于对照组，且瘤胃液IgG滴度与对照组相比显著提高了5倍，对照组和接种组平均甲烷排放量分别为13.5和14.3 g/kg DM，虽然未降低甲烷产量，但抗体滴度显著增加。Williams等[25]利用5种产甲烷菌混合配制成疫苗给绵羊皮下免疫，结果表明，绵羊血浆、唾液中IgG滴度增加，瘤胃中甲烷菌多样性显著增加，可能是该疫苗改变了甲烷菌群组成，但未显著减少甲烷生成量。Wright等[26]测试2种不同疫苗佐剂对甲烷减排效果，经皮下免疫注射，结果表明，IgG含量升高4～9倍，绵羊的甲烷排放量减少7.7%，IgG对甲烷排放量起到了抑制作用。Cook等[27]制备抗甲烷菌IgY免疫母鸡进行2个体外瘤胃试验，结果表明，在12 h时降低了甲烷产量，24 h时平均甲烷产量为27.03 mg/g DM，所有处理组甲烷水平均与对照组相似，证明IgY可以短暂减少产甲烷菌产生的甲烷，抗体对甲烷产生的抑制瞬时作用可能是由瘤胃液中抗体的不稳定性或不受施用抗体活性影响的产甲烷菌存在引起的。由于瘤胃微生物菌群的复杂性和产甲烷菌的多样性，抗原选择上应具有广谱性，目前大量甲烷菌还未被培养，抗原信息还有限，所以需要利用基因组或宏基因组筛选抗原靶点，制备出更广谱的疫苗去针对特异性产甲烷菌，抑制甲烷产量。
2.2 减缓尿素分解
通过在饲料中添加尿素给反刍动物提供非蛋白氮来源，可以替代饲粮中的部分蛋白质饲料。从饲料或血液循环到瘤胃的尿素被脲酶水解为氨，并被用于合成微生物蛋白，节约豆粕用量。脲酶活性偏高，导致尿素在瘤胃内分解速度较快，氨的产生速度是同化速度的4倍，使得氨被吸收入血液，大部分被排出体外。当血液中氨浓度在2 mg/100 mL以上时会引起氨中毒；
而当血液中氨浓度为5 mg/100 mL时会引起动物中毒死亡[28]。研究者通过开发和研究不同的脲酶抑制剂来减少瘤胃内氨的生成，但其功效会随着时间延长而降低，同时部分抑制剂也会残留在动物体内，对其健康及生殖性能造成危害。因此，目前通过免疫的方法对瘤胃脲酶进行调控，以减缓尿素在瘤胃内水解，从而节约蛋白质饲料成本。脲酶由2～3个结构亚基组成，亚基UreC包含1个尿素结合位点和1个催化位点。Zhao等[29]通过基因工程的方法来抑制奶牛瘤胃内尿素的分解，表达制备幽门螺杆菌脲酶作为抗原，加入弗氏佐剂后免疫奶牛，结果发现对奶牛的健康、产奶量等均无明显影响，但接种疫苗的奶牛从第7天开始血清IgG和IgA滴度显著高于对照组，而唾液IgG和IgA滴度分别从第7和21天开始显著高于对照组，在第49天(第3次免疫后2周)免疫组的脲酶活性比对照组低17%，说明抗脲酶的特异性抗体可以降低脲酶活性。Marini等[30]以刀豆脲酶作为抗原免疫调控瘤胃中脲酶活性，结果表明，经刀豆脲酶免疫后，奶牛血清内免疫球蛋白浓度显著升高，但细菌脲酶活性没有降低，也没有改变尿素代谢。表明相比较于植物脲酶，细菌脲酶与瘤胃细菌脲酶的亲缘关系更近，所产生的免疫球蛋白对瘤胃脲酶活性调控效果更佳。因此，需要表达出特异性细菌脲酶产生更近的亲缘关系，可以更高效地调控脲酶，从而减缓瘤胃内尿素分解。
2.3 减少原虫数量
反刍动物瘤胃原虫与氮等营养素代谢密切相关。瘤胃内原虫不能利用氨态氮(NH3-N)合成自身蛋白质，只能利用微生物或饲料中的蛋白质作为主要氮源，推测减少瘤胃原虫数量可能有利于提高瘤胃氮利用率。因此，研究者通过免疫球蛋白调控瘤胃内原虫数量，稳定瘤胃内氮的产量。Williams等[31]利用绵羊瘤胃的内纤毛虫作为抗原制备疫苗免疫绵羊，结果表明，接种后的绵羊IgG滴度比对照组升高了5倍，瘤胃内原虫特异性滴度升高了3倍，但瘤胃内纤毛虫数目并没有减少；
进一步将过量特异性抗体注入瘤胃内，使过量的抗体在瘤胃内停留时间延长，从而使原虫和抗体充分结合，结果表明原虫数量显著降低[32]。苑文珠等[33]研究发现，原虫是瘤胃内产甲烷微生物之一，驱除瘤胃原虫后，瘤胃内甲烷的产量减少。Leahy等[34]利用产甲烷菌的基因组序列及一些小分子的抑制剂作为免疫球蛋白，用产甲烷菌制备疫苗，发现其可以对产甲烷菌的功能起到一定作用，显著减少了甲烷产量，说明纤毛虫抗原与抗体特异性结合的程度越高，对其数量的影响越显著。因此，目前需要基于基因组序列去筛选以识别编码具有良好疫苗靶标属性蛋白质的基因来确定原虫疫苗靶点，从而进一步调控原虫数量。
2.4 减缓淀粉分解
为了追求高质量的畜产品，饲养反刍动物时往往会饲喂一些高淀粉含量的精料。淀粉分解菌主要是靠消化胃肠道内的淀粉而生长繁殖[35]，但通常情况下瘤胃内pH为6.5～7.5。当大量摄入淀粉后，瘤胃内会大量积累乳酸，使得pH迅速下降，当pH低于5.5时，就会发生酸中毒[36]。Dennis等[37]通过在饲粮中添加抗生素来降低淀粉的分解率，但抗生素的使用存在着很多的弊端，如药物残留等。牛链球菌是淀粉分解菌属中的一种，会在胃肠内产生大量乳酸。Gill等[38]利用牛链球菌作为抗原去免疫绵羊，结果表明，免疫组动物瘤胃pH显著升高，瘤胃内乳酸浓度显著降低，免疫后血清和唾液中免疫球蛋白水平均显著升高。Mizuguchi等[39]利用抗脂多糖(lipoolysaccharide,LPS)免疫球蛋白，研究免疫球蛋白中和LPS的作用，结果表明，抗LPS免疫球蛋白可以减缓瘤胃LPS释放和pH降低。Shu等[40]以肉牛为试验动物，以牛链球菌和乳酸杆菌作为抗原制备疫苗，经免疫后动物瘤胃内乳酸浓度显著降低，且酶链免疫结果表明，IgG滴度升高。因此，免疫球蛋白可用于调控瘤胃内的乳酸浓度。
胃肠道内致病菌会使家畜感染或菌群失调，从而导致腹泻，主要致病菌和病毒有轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒及大肠杆菌。
3.1 轮状病毒
轮状病毒(Rotavirus,RVA)是胃肠内存在的一种致病畜腹泻的病毒，RVA对外界环境的抵抗力较强，在18～20 ℃的粪便和乳汁中能存活7～9个月，因而其在家畜和幼畜之间容易反复循环感染[41]。研究者早期通过给幼畜饲喂初乳的方法来增强免疫活性，降低RVA感染率，之后相继开发出一些疫苗来抵御该病毒。Odagiri等[42]用2个不同基因型的RVA从免疫母鸡中获取IgY来制备抗RVA免疫球蛋白，通过肌肉注射方式去探究其是否可以保护犊牛免受RVA的影响，结果表明，免疫后IgY浓度升高，2种抗原的IgY浓度分别为40.1和53.4 mg/mL，而对照组IgY浓度为30.3 mg/mL。Vega等[43]给荷斯坦牛口服灭活RVA后发现，添加IgY组显著减少了粪便中RVA检出时间，从11.6 d下降到4.5 d，同时减少了试验动物腹泻持续期，从7.2 d下降到3.2 d。因此，IgY对家畜抵御RVA表现出正面影响。
3.2 牛病毒性腹泻病毒
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)也是一种致使病畜腹泻的病毒之一，属于黄病毒科瘟病毒属[44]。目前已有针对BVDV的疫苗，其核心是BVDV结构蛋白E2与单链免疫球蛋白APCH的融合，统称为APCH-E2。免疫球蛋白APCH将E2抗原靶向存在于抗原呈递细胞上的主要组织相容性Ⅱ型分子(major histocompatibility complex,MHC-Ⅱ)，该疫苗的优点是可以在牛身上快速诱导并产生持续的中和免疫球蛋白反应[45]。Duan等[46]利用BVDV的非结构蛋白5 (nonstructural protein 5A,NS5B)，通过从纳米基因库中分离出NS5B特异性纳米体，进一步建立稳定表达的细胞株，探讨其抗病毒活性，结果表明，免疫后双峰骆驼的抗血清滴度增加到1∶128 000，随机选取50个克隆进行测序分析，每个克隆包含1个明显的VHH序列，该纳米库多样性高，说明VHH对抵御BVDV起到了正面的作用。
3.3 致病性大肠杆菌
大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)也是致使腹泻的致病菌之一，随着动物患病率越来越高，对大肠杆菌的免疫方法越来越受到人们的重视。根据大肠杆菌的致病特性不同，可分为4～5类，如肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasiveEscherichiacoli,EIEC)、产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)等[47-48]。Alustiza等[49]探讨给仔猪饲喂1 011 CFU/mL IgY对ETEC的影响，结果表明，饲喂IgY组没有出现腹泻等症状，但未饲喂组在第4天中性粒细胞及白细胞数量显著增加，胃肠道可能被ETEC感染。Virdi等[50]将羊驼抗ETEC重链免疫球蛋白的可变结构域与猪免疫球蛋白(IgG或IgA)的Fc部分融合，设计出抗ETEC免疫球蛋白，并在拟南芥种子中表达，通过这种方法产生了4个VHH-IgG和4个VHH-IgA，分别约为种子重量的3.0%和0.2%；
对所有产生免疫球蛋白的种子提取物的体外分析表明，它们对细菌与猪肠道绒毛肠细胞的结合具有抑制作用，然而在仔猪饲粮试验中发现，只有添加VHH-IgA的仔猪被保护，且ETEC数量逐渐减少，起到了积极免疫作用，证实了该免疫球蛋白可以抑制ETEC病原体的数目。Chin-Fatt等[51]用1个单一结构域VHH和1个免疫球蛋白的可结晶片段(Fc)融合而成嵌合融合蛋白，构建了一组本氏烟叶片转化的内部表达载体，通过分泌(Sec)或双精氨酸易位(Tat)途径将VHH-Fc靶向到该叶片的类囊体腔，对从Sec、Tat和基质途径纯化的VHH-Fc的体外免疫荧光标记分析表明，该免疫球蛋白在结合大肠杆菌O157∶H7时仍然保留VHH功能，蛋白含量从50.24 mg/kg FW增加到110.90 mg/kg FW，证实了其在中和大肠杆菌O157∶H7对胃肠道上皮细胞的黏附方面具有重要作用，从而调控大肠杆菌的功能。
4.1 疫苗免疫
疫苗作为一种主动免疫方式，较其他免疫方法相对安全，成本低，方便制备。在畜牧业领域，各类病毒也有相关的疫苗已成功研发，目前被广泛应用的疫苗主要有口蹄疫病毒疫苗、猪瘟疫苗等，但还有很多新的疫苗等待人们去研发制备。F4是一种主要抗原，在感染的早期阶段起着重要的作用。Faribrother等[52]以表达F4的非致病性大肠杆菌为载体研制了一种口服活疫苗，对猪的产后断奶腹泻(postpartum weaning diarrhea,PWD)免疫效果进行了评定，结果发现，接种疫苗后7和21 d，中度到重度腹泻、F4-ETEC回肠定植和F4-ETEC粪便排泄的发生率显著降低，且疫苗接种后3 d，F4-ETEC的腹泻和排便的严重程度和持续时间降低，该抗原的特异性免疫功能得到证实。Buddle等[53]通过基因组来筛选用于识别合成甲烷的微生物蛋白，这些蛋白可用于开发抗血清和广谱疫苗。Wedlock等[54]已研制出针对特定的产甲烷菌的疫苗。但是疫苗免疫也存在一定的弊端，如存在抗原损害可能性，免疫维持时间短，需要进行多次注射，疫苗的接种时间较长。因此，开发出新的更高效价疫苗已成为一个必然趋势，而且随着新冠肺炎疫情的暴发，在疫情的控制方面都离不开疫苗的开发与研究[55]。
4.2 饲粮饲喂
通过提取免疫球蛋白添加到饲料中，不仅避免了抗生素残留等问题，同时可用于动物疾病的防疫。Vandeputte等[56]在家禽饲料中添加含抗空肠弯曲杆菌的IgY免疫球蛋白，结果表明，添加IgY免疫球蛋白后IgY滴度显著提高(1∶32 768～1∶65 536)，免疫组有效降低了空肠弯曲杆菌的定植率，推测添加该抗体于饲料中可降低家禽的致病率。猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种高度传染性的猪肠道病原体，该病毒对仔猪的致死率较高[57]。崔焕忠等[58]给仔猪饲喂抗PEDV抗体，结果表明，饲喂IgY 5 d后治愈率达100%，未口服组全部死亡。Lee等[59]制备了抗PEDV和抗PEDV S1蛋白的IgY免疫球蛋白，并研究了其对新生仔猪的免疫预防作用，结果表明，排泄物中病毒的滴度分别下降了42.6%和29.6%，说明口服抗PEDV和S1 IgY能有效降低新生仔猪免受PEDV感染的风险。
免疫球蛋白在调控瘤胃微生物功能代谢如抑制甲烷排放和尿素分解等方面研究较多，但由于瘤胃微生物菌群的复杂性和多样性，抗原选择上应具有广谱性，所以仍需利用基因组或宏基因组筛选抗原靶点，制备出更广谱的疫苗去针对特异性菌。在维护动物胃肠道方面，目前已有特异性免疫球蛋白去针对特异性疾病，但仍存在一些问题需要去改进和完善：①如何提高免疫球蛋白在机体内水平；
②如何减少免疫球蛋白的生产成本；
③抗体如何发挥作用。以上问题将为人们进一步探讨免疫球蛋白调控胃肠道微生物功能提供参考，从而为更高效的饲料营养设计和动物疫苗免疫提供新思路。
