无瓣海桑来源内生真菌Aspergillus,sp.HNY16-5B中的二聚呫吨类化合物*
时间：2023-02-19 21:25:04 来源：千叶帆 本文已影响人
刘亚月，吴颖楠，佘志刚
1. 广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088
2. 中山大学化学学院，广东 广州 510006
曲霉Aspergillus按生物分类学分类归入半知菌亚门Deuteromcotina、丝状菌纲Hyphomycetes、丝孢目Hyphomycetales、从梗孢科Moniliaceae，拥有不少于170 种亚种，是一类重要的微生物菌种资源［1-2］。目前常见的曲霉有棒曲霉Aspergillus clavatus、灰绿曲霉Aspergillus gluucus、黄褐曲霉Aspergillus cervinnus、烟曲霉Aspergillus fumigatus、费氏曲霉Aspergillus fisheru、黑曲霉Aspergillus niger、白曲霉Aspergillus candidus、黄曲霉Aspergillus flavus、文氏曲霉Aspergillus wentii、土曲霉Aspergillus terreus等［3］。
作为目前最大、最广泛被研究的真菌菌属之一，曲霉为大量结构新颖的活性代谢产物的产生提供了无限可能［4-11］。中科院王斌贵课题组［6］从深海冷泉真菌Aspergillus insuetusSD-512 中分离获得3 个新的蛇孢菌素二倍半萜和3 个新的法尼基化苯酞衍生物。活性测试表明化合物显示广泛的抑菌活性。澳大利亚学者Capon 等［7］从Aspergillussp. CMB-MRF324 中分离获得6 个新的单萜millmerranones A-F，乙酰胆碱酯酶抑制活性显示，6 个化合物均显示较强的抑制活性（IC50<3.8 μmol/L）。中山大学佘志刚课题组［8］从采集自海南东寨港红树林自然保护区的红树植物海桑内生真菌Aspergillussp. 中获得了1 个新骨架的二倍半萜化合物asperterpenoid A。活性研究表明，该化合物显示强的mPTPB抑制活性（IC50=2.2 μmol/L）。同年，该课题组肖泽恩博士［9］对广西山口国家红树林保护区红树植物老鼠簕Acanthus ilicifolius的根部中分离得到1 株内生真菌Aspergillussp. 进行分离研究，得到2个含有5/8/6/6四环新骨架的二倍半萜类化合物asperterpenols A 和B。乙酰胆碱酯酶抑制活性研究表明，两者均对乙酰胆碱酯酶显示强的抑制活性（IC50值分别为2.3 和3.0 μmol/L）。德国学者［10］从地中海Limski 运河的海绵真菌中分离得到7 个新的生物碱化合物，其中包括tryptoquivaline K 和6 个含有罕见的1-氨基环丙烷-1-羧酸残基片段的fumiquinazolines K-P，该真菌经鉴定也属于Aspergillussp.。因此，开展曲霉属真菌次级代谢产物的研究具有广泛的研究前景。
本论文对分离自海南东寨港红树林自然保护区的红树植物无瓣海桑Sonneratia apetala的内生真菌Aspergillussp. HNY16-5B 进行了发酵培养，并对其次级代谢产物进行了分离纯化和结构鉴定工作，从中获得了5个二聚呫吨化合物类化合物。经核磁解析和与文献数据比对，确定了化合物的结构，依次为asperpyrone B（1），fonsecinone A（2），aurasperone A（3），asperpyrone A（4）和dianhydroaurasperone C（5）（图1）。本论文首次通过Cu Kα的X-Ray单晶衍射，确定了化合物2的轴手性为S。并通过对比CD 谱，可确定其他的化合物的轴手性均为S。
图1 化合物1～5的结构Fig.1 The structure of compounds 1-5
AVANCE Ⅲ400 和500 MHz 核磁共振波谱仪（Bruker BioSpin，瑞士）；
Chirascan ™CD 光谱仪（Applied Photophysics，英国）；
DSQ EI-MS 质谱仪（Thermo Fisher，美国）；
Agilent X 射线单晶衍射（Agilent，美国），铜靶；
HPLC：Agilent HP 1100高效液相色谱仪（Agilent，美国），Ultimate®XB-C18（5 μm，10 mm×250 mm）色谱柱。薄层层析GF254硅胶板（青岛烟台，中国）；
200-300 目柱层层析硅胶（青岛海洋化工厂，中国）；
Sephadex LH-20（GE Healthcare，英国）；
ODS 色谱填料（YMC，日本）；
常规试剂均为分析纯。
菌株HNY16-5B采集于中国海南东寨港红树林自然保护区，由红树植物无瓣海桑Sonneratia apetala的树叶中分离得到。通过用真菌ITS 引物ITS1 和ITS4 扩增真菌DNA 序列［12］，所得的碱基序列在GenBank 中用BLAST 进行进化树相似性分析，鉴定为曲霉属真菌Aspergillussp.。该菌种的DNA 序列已提交至GenBank（序号KP059102），该菌株目前保藏在中国典型培养物保藏中心。
菌株HNY16-5B 在25 ℃下用察氏培养基发酵，培养基配方为：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾1 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，1 L水。经121 ℃灭菌25 min、冷却后，接入种子液5 mL，静置培养的时间为28～30 d。
发酵物用等体积的二氯甲烷/甲醇提取3 次，获得有机相；
有机相通过减压浓缩后；
再用乙酸乙酯萃取3 次，浓缩得到6.9 g 粗浸膏。所得粗浸膏通过柱层析（硅胶：200～300 目）进行初步分离，以石油醚-乙酸乙酯（体积比为90∶10，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60，25∶75，100∶0）为流动体系进行梯度洗脱，收集得到7 个组分（Fr. 1～Fr. 7）。各组分经TLC 检测后，对Fr.5（836 mg）进行正相硅胶柱层析，用氯仿-甲醇（体积比为50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，1∶1）梯度洗脱，收集获得12个组分（Fr.5-1～Fr.5-12）。组分Fr.5-7 常温下静置挥发获得固体不溶物，分别用石油醚、二氯甲烷和甲醇洗涤3 次，获得化合物1（7.5 mg）。对组分Fr.5-7采用甲醇进行重结晶，晶体分别用石油醚和甲醇洗涤3 次，获得化合物2（15.5 mg）。将Fr. 4（128 mg）通过半制备HPLC进行分析，流动相为甲醇-水，体积比为65∶35 等度洗脱，流速为2 mL/min，相应获得化合物3（tR=27.5 min，5.5 mg）和4（tR= 31.0 min，3.8 mg）；
将Fr. 6（228 mg）多次使用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20［氯仿-甲醇（体积比1∶1）；
纯甲醇体系］，收集获得8 个组分（Fr.6-1～Fr.6-8）。组分Fr.6-4常温下静置挥发获得固体不溶物，分别用石油醚、二氯甲烷和甲醇洗涤3次，得到化合物5（10.9 mg）。
采用比色法［13］测定化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果显示化合物1～5对α-葡萄糖苷酶均没有明显的抑制活性（IC50>200 μmol/L）。
4.1 菌株鉴定
菌株HNY16-5B 经rDNA 的ITS 序列测定，测序结果如下：
将菌株HNY16-5B 与NCBI 数据库进行比对后，选择数据库中序列相似性较高的已有序列进行BLAST，并使用MEGA7.0 构建进化树（图2）。进化树结果表明HNY16-5B属于Aspergillussp.。
图2 HNY16-5B的进化树Fig.2 The evolutionary tree of HNY16-5B
4.2 结构鉴定
化合物1，黄色粉末，［α］+2.8（c0.01 CHCl3），EI-MS 给出分子离子峰为m/z556［M］+，结合1H 和13C NMR 推断该化合物的分子式为C31H24O10，不饱和度Ω=20，说明分子中存在大量不饱和体系。1H NMR 谱图给出了2 个螯合羟基质子信号δH13.42 和δH12.68；
一组间位耦合质子信号δH6.47（d，J=2.2 Hz）和6.25（d，J=2.2 Hz）；
4 个孤立的芳香质子信号δH7.13，δH6.96，δH6.31，δH6.29；
3 个 甲 氧 基 质 子 信 号δH4.00，δH3.63，δH3.61；
以及2 个甲基质子信号δH2.54 和δH2.46。13C NMR谱图中显示有31个碳信号：包括2个酮羰基 碳δC183.0 和δC182.8；
3 个 甲 氧 基δC61.7，δC56.2，δC55.5；
2 个甲基碳δC20.7 和δC20.7；
以及24 个成对出现的sp2杂化碳，结合氢谱中给出的2 个特征性螯合羟基质子信号，说明该化合物可能是1个角型萘并吡喃-γ-酮的二聚体。HMBC谱图中（图3），由H-9′和C-7′，C-8′，C-10′，C-14′有相关；
H-7′和C-6′，C-8′，C-9′，C-14′有相关；
H-3′和C-2′，C-4′，C-12′有相关，可推断其中1 个单元的骨架为2，5，6，8，10-五取代萘并角型吡喃-γ-酮。进一步分析HMBC 谱图可知，2 个甲氧基质子δH4.00 和δH3.63 分别和C-8′和C-10′相关，表明这2 个甲氧基分别连在8′位和10′位的碳上。通过同样的方法确定另1 个单元的骨架也为2，5，8，9，10-五取代角型萘并吡喃-γ-酮的二聚体。经文献检索发现，该化合物的核磁数据（表1）与已知化合物asperpyrone B的核磁数据一致［14］，故鉴定化合物1为已知化合物asperpyrone B。
图3 化合物1的HMBC相关示意图Fig.3 The HMBC correlations of compound 1
化合物2，黄色粉末，［α］+ 12.4（c0.01 CHCl3），EI 质谱显示分子离子峰为m/z为570［M］+。结合1H 和13C NMR 推断该化合物的分子式为C32H26O10，不饱和度Ω= 20。通过对比1 和2的1H NMR 和13C NMR 数据可知（表1），化合物2也是1 个萘并吡喃-γ-酮二聚体。但是在1的1H NMR 谱图的低场区，其中1 个螯合酚羟基质子信号向更低场移动至δH15.24（线型萘并吡喃-γ-酮螯合酚羟基质子的典型特征），表明化合物2的1个结构单元由角型转变为线型。且比化合物1 多1个甲氧基质子信号δH3.43。经查阅文献，鉴定化合物2 为已知化合物fonsecinone A［15］。核磁数据如表1 所示。通过培养成功获得了化合物2 的单晶，并利用铜靶X-Ray 单晶衍射技术［16］确定了该化合物的轴手性为S。单晶数据如表2 所示，单晶结构见图4。
图4 化合物2的单晶ORTEP图Fig.4 Perspective ORTEP drawing of compound 2
表2 化合物2的单晶衍射数据表Table 2 Crystal parameters of compound 2
化合物3，黄色粉末，［α］+ 87.5（c0.01 CHCl3），EI 质谱显示分子离子峰为m/z570［M］+，与化合物2 的相对分子质量一样。而比较两者的1H NMR 和13C NMR 谱图，发现其信号值极其相似。除了化合物3 中的2 个螯合酚羟基质子信号均处于更低场δH15.25 和δH14.83，故推测构成该化合物的2个单元均应为线型萘并吡喃-γ-酮。经检索文献，发现与化合物aurasperone A 核磁数据吻合，故鉴定化合物3 为已知化合物aurasperone A［17］。核磁数据如表1所示。
表1 化合物1～5的13C NMR（CDCl3）和1H NMR（CDCl3）数据表Table 1 The 13C NMR（CDCl3）and 1H NMR（CDCl3）data of compounds 1-5
化合物4，黄色粉末，［α］+ 17.0（c0.01 CHCl3），EI-MS 给出分子离子峰为m/z556［M］+，结合1H 和13C NMR 推断该化合物的分子式为C31H24O10，不饱和度Ω= 20。对比化合物4 和2 的核磁数据可知，前者比后者少了1个甲氧基信号δH3.78，而其他信号基本一致。经文献检索，发现与化合物asperpyrone A 的核磁数据一致，故鉴定化合物4 为已知化合物asperpyrone A［18］。核磁数据如表1所示。
化合物5，浅黄色粉末，［α］+ 9.5（c0.01 CHCl3），EI-MS 给出分子离子峰为m/z556［M］+，结合1H 和13C NMR 推断该化合物的分子式为C31H24O10，不饱和度Ω= 20。对比化合物5 和3 的核磁数据可知，前者比后者少了1个甲氧基信号δH4.00，而其他信号基本一致。经文献检索，鉴定化合物5 为已知化合物dianhydroaurasperone C［19］。核磁数据如表1所示。
轴手性是二聚萘并吡喃-γ-酮类化合物绝对构型确定时的一个难题。Koyama 等［20］和杨颖等［21］研究了chaetochromin A 及相似的二聚萘并吡喃-γ-酮类化合物的绝对构型。通过X-Ray单晶衍射数据分析，他们得出了化合物chaetochromin A 的轴手性构型为S，这与通过手性激子方法所得出的结果一致。经过多方研究验证，他们得出了以下结论：以280 nm 为分割带（从长波长往短波长看），当化合物出现先负后正的Cotton effect 吸收时，确定化合物为R-构型；
而当化合物出现先正后负的Cotton effect 吸收时，确定化合物为S-构型。通过观察化合物1～5 的CD 谱可知，五者均在280 nm 处具有先正后负的Cotton effect 吸收，因此可确定上述化合物均为S构型（图5）。这与通过单晶确定的2的轴手性结果一致。
图5 化合物1～5的CD曲线Fig.5 The CD spectra of compounds 1-5
猜你喜欢 核磁单晶质子 上海某三甲医院CT、核磁大型影像设备的管理、配置和使用分析现代仪器与医疗(2022年4期)2022-10-08基于低场核磁成像的银杏胚检测及分类农业工程学报(2022年6期)2022-06-27老人摔倒为何需要拍核磁？科学导报(2022年4期)2022-01-26低温辐射量热器用钼酸锂单晶研制人工晶体学报(2021年10期)2021-11-26蓝宝石单晶炉隔热屏内胆损坏机理粉末冶金技术(2021年3期)2021-07-28对部分子碎裂为质子的碎裂函数的研究华东师范大学学报（自然科学版）(2019年2期)2019-06-11有机卤化铅钙钛矿单晶材料的生长和应用研究现状中国科技纵横(2018年3期)2018-03-15几种盐溶液中质子守恒的推导及其应用新课程·下旬(2018年10期)2018-01-28物质构成中的“一定”与“不一定”中学生数理化·中考版(2016年8期)2016-12-07X光、CT和核磁如何选百姓生活(2016年6期)2016-06-22 相关热词搜索：真菌，内生，来源，
