一套适合烤烟3种RNA病毒的RT-PCR检测方法
时间：2023-02-20 08:10:08 来源：千叶帆 本文已影响人
祖庆学，李宏江，聂忠扬，于晓飞，张翼飞，李昊熙*
（1.贵州省贵阳市烟草公司开阳县分公司 贵阳市 550300；
2.贵州大学烟草学院/贵州省烟草品质研究重点实验室 贵阳市 550025）
烤烟是贵州省的一种重要经济作物，但是烤烟生产受到多种病虫害的威胁。烟草花叶病毒（To⁃bacco mosaic virus，TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucum⁃ber mosaic virus，CMV）和马铃薯Y病毒（Potato vi⁃rus Y，PVY）3种正义单链核糖核酸（+ssRNA）病毒长期困扰了贵州各个主要烟区[1-4]。病毒病不仅降低了烤烟产量，还影响了产品的质量和分级，造成了巨大的经济损失[5]。由于植物病毒的治疗手段非常有限，抗病毒品种的选育和早期染病植株的清除是控制病毒病的主要手段[6]。3种病毒中，CMV和PVY主要经过蚜虫等介体昆虫进行非持续性传播，而TMV则主要依靠机械摩擦传播，因此，针对性开展的阻断传播的防控手段就不尽相同。所以，病毒种类的快速和高效地检测是非常重要的工作。3种RNA病毒寄主范围很广，主要包括辣椒、马铃薯等蔬菜作物，还有许多种杂草。在烤烟植株上，TMV和CMV都表现出了相似的“花叶”病状，主要表现在幼株叶片不规则褪绿、叶片卷曲，以及成株矮小甚至整片叶面黄化等现象。而PVY的田间症状与前面2种差异较大，比如沿着叶脉的褪绿[7]。而病毒病症状易受烟株的发育程度、气候条件和病毒株系的影响，增加了田间判断发病与否以及区分症状种类的难度。近年来，多种病毒的复合侵染烤烟的报道逐渐增多[8-9]，进一步加大了病毒检测工作的难度。
目前植物病毒检测主要采取血清学和分子生物学方法[6]。血清学方法常借助于预先准备特异性抗体相关的材料[9-11]，而分子生物学检测所需的PCR仪等常规装置，因其实验条件、设备以及操作方法简单等优点，更容易成为生产实践推广的快速检测技术。本研究利用基层检测站点的PCR仪等设备，通过靶定外壳蛋白基因特异性区域设计引物和PCR条件，开发一套针对贵州烟区3种RNA病毒（TMV、CMV和PVY）的检测方法。
1.1 烤烟样品的采集
2020年7月采集烤烟旺长期的感染病毒叶片，叶片样品包括4种症状类型，使用Agdia牌试纸条检测了感染病毒的种类，详细标本的名称、症状、采集地与烟草品种的信息如表1所示。
表1 染病烟叶样品的相关信息
1.2 样品总RNA的提取及其c DNA的合成
每个样品称取100 m g的叶片组织，加入液氮后充分碾磨，将碾碎的粉末加入离心管中用于总RNA的提取。提取步骤参照RNeasy®Plant Mini Kit（Qiagen）试剂盒：首先在碾磨充分的样品加入450μL的RLT缓冲液，振荡均匀；
然后将混合液体转入配套的QIAshredder层析管中，14 000 r/min离心2 min，在上清液中加入1/2体积的无水乙醇；
又将混合液体转入配套的RNeasy层析管中，14 000 r/min离心15 s后，用RW1缓冲液洗脱1次，RPE缓冲液洗脱2次；
最后用30μL去RNA酶溶解总RNA产物。RNA提取前用0.1%的DEPC水处理所有工具与操作台，杜绝RNA酶干扰。
使用2μL的总RNA作为模板进行逆转录反应，反应参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（ThermoScientific）的25μL反应体系，包括了：1μL的Oligo（dT）18引物混合物，4μL的5×Reaction Buffer，1μL的RiboLockRNase Inhibitor（20 U/μL），2μL的dNTP混合液（10 mM），1μL的RevertAid MMuLV RT（200 U/μL）。得到的cDNA保存用于后续检测反应。
1.3 PCR引物设计及PCR反应
从GenBank中下载得到TMV（No.NC_001 367）和PVY（No.NC_001 616）的全基因组序列，CMV基因组中包含了外壳蛋白（Coat Protein，CP）基因的第III片段（No.NC_001 440）的序列，以及各个基因组中外壳蛋白编码基因的具体范围信息。分别针对3种病毒的外壳蛋白基因特异性区域设计了3对引物，如表2所示。主要的设置条件是3对引物覆盖的基因片段的长度具有较大的差异，分别为：TMV-120 bp，CMV-240 bp和PVY-660 bp，退火温度均为55˚C。
表2 3种病毒的引物序列
PCR反应的程序为：94℃预变性5 min；
94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25个循环；
最后72℃延伸7 min，4℃保存。
1.4 单一引物检测
将3对引物分别与3种病毒的cDNA进行PCR反应，检测所设计引物的特异性。具体操作如下：利用3个单一病毒侵染叶片样品（T、C和P）得到的cDNA作为模板，分别与设计的3对特异性引物进行PCR反应。反应体系为25μL，包括：1μL的cDNA模板，10 mmol/L的上、下游引物，13μL的2X SanTaq PCR Master Mix（with Blue Dye，生工 生物）。反应条件同1.3。PCR反应的结果用凝胶电泳检测。
1.5 3对引物的混合体系检测
构建3对引物的混合体系，反应体系为25μL，包括：1μL的cDNA模板，10 mmol/L的全部3对上、下游引物的混合物，13μL的Qiagen Multiplex PCR Master Mix，然后对样品进行PCR反应，检测感染病毒的种类。首先将3个单一病毒侵染样品（T、C和P）的cDNA分别作为模板，无DNA模板的反应（N）作为空白对照进行反应。其次利用同时被2种病毒感染的叶片（D）得到的cDNA作为模板，无DNA模板的体系（N）作为空白对照，分别重复2次进行反应。然后利用3个单一感染样品的cDNA的混合物（M）作为模板，无DNA模板的体系（N）作为空白对照，也分别重复2次进行反应。PCR反应条件全部同1.3。PCR反应的结果用凝胶电泳检测。
2.1 样品的免疫试剂条检测
采集到的感染病毒的烤烟叶片样品的免疫试纸条检测结果如表1所示，样品T、C和P分别仅仅感染了烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯Y病毒（PVY），样品D同时感染了CMV和PVY。
2.2 引物特异性的PCR检测
在相同的PCR反应程序下，3对引物分别能够特异性地从3种病毒的cDNA中扩增出外壳蛋白片段条带。如图1所示，TMV引物（TMV_CP_F1与TMV_CP_R1）仅仅只能从含TMV的样品T的cDNA模板中扩增出对应的120 bp的片段，而CMV（CMV_CP_F1与CMV_CP_R1）和PVY（PVY_CP_F1与PVY_CP_R1）的引物仅能从对应的引物中扩增出240 bp和660 bp的特异性片段。
图1 3对引物（A-TMV引物，B-CMV引物，C-PVY引物）分别针对3种病毒（T-TMV，C-CMV，P-PVY）的c DNA的PCR电泳图
2.3 单一感染的检测结果
在相同的反应程序下，通过1次相同的PCR反应，3对引物的混合体系就分别特异性地从3种病毒的cDNA中扩增出对应大小的外壳蛋白片段条带。如图2所示，引物混合体系仅能从样品T、P和C的cDNA模板中扩增出120 bp（TMV）、660 bp（PVY）和240 bp（CMV）片段，空白对照无反应。
图2 3对引物混合检测单一感染样品（T-TMV，P-PVY，C-CMV，N-空白对照）的病毒种类PCR反应电泳图
2.4 双重感染的检测结果
通过3对引物混合体系的PCR反应，也能够根据扩增出条带的大小检测双重侵染样品中2种病毒的种类。如图3所示，引物混合体系从样品D的2个重复反应（D1和D2）中扩增出2条条带，大小分别是240 bp（CMV）和660 bp（PVY），空白对照（N1和N2）无反应。
图3 3对引物混合检测双重感染样品（D-CMV和PVY，N-空白对照）的病毒种类PCR反应电泳图
2.5 3种病毒c DNA混合物的检测结果
通过3对引物混合体系的PCR反应，还能够根据扩增出条带的大小检测3种病毒DNA混合物的种类。如图4所示，引物混合体系从TMV、CMV和PVY 3种病毒cDNA混合物M的2个重复反应（M1和M2）中扩增出3条条带，大小分别是120 bp（TMV）、240 bp（CMV）和660 bp（PVY），空白对照（N1和N2）无反应。
图4 3对引物混合检测3种病毒混合DNA（M-TMV、CMV和PVY混合，N-空白对照）的种类PCR反应电泳图
目前贵州烟区主要病毒病的鉴定是依靠症状表现，但是由于田间症状的差异性不明显，加上相关寄主、介体昆虫和复合侵染的广泛存在，鉴定烤烟是否感染病毒以及确定病毒的种类都给经验缺乏的烟农和基层烟叶站人员增加了困扰。病毒检测试纸条则大大提高了准确性，如开阳在内的部分分公司、烟叶站配置了试纸条，精确性非常高。但是在同时检测大量症状类似的材料时，尤其是复合侵染材料检测，成本就提高了，时间上的效率也下降。混合样品的检测技术就应运而生，这种利用混合引物设计反应条件的PCR检测方法在国内外被广泛报道，如检测日本红薯的4种RNA病毒[12]、匈牙利辣椒的3种RNA病毒[13]、我国西红柿的6种病毒[14]与甘薯的3种RNA病毒[15]。在这些研究中，外壳蛋白都是重要的分子标记，因为外壳蛋白是病毒基因组的主要组成部分，也在很大程度上体现了病毒种类的多样性[16]。我国烤烟生产中也先后开发了2套PCR检测体系，分别针对3种[17]与5种[18]RNA病毒，而且2套检测方法均涉及到了退火温度与cDNA模板浓度的优化，因而具有非常高的检测精确性，而基层检测站点往往不能达到相应的工序要求。目前，贵州烟区还比较缺乏相关方面的研究。
本研究针对贵州烟区田间感染病毒的鲜烟叶样品材料，靶向3种+ssRNA病毒（TMV、CMV和PVY）外壳蛋白基因，设计了3对特异性引物的混合体系与相同退火温度（55˚C）配套的PCR反应程序，其中的6条引物全部是单义碱基。通过1次PCR反应，就可以根据扩增条带的长度，一次性检测RNA病毒的种类，可一次性检测出复合侵染的2种病毒，也可以检测出3种病毒cDNA混合物的种类，因而具备检测出其他类型复合侵染的理论可能性。PCR反应不需要调节DNA模板的浓度与退火温度梯度，产生条带的大小差异也很大，适合经验不足的操作人员辨认，整套工序利用基层检测站点的PCR仪等设备就可以完成操作与识别。综上所述，本套检测方法非常适合基层检测站点快速和高效地检测大批量烟叶样品，为后续的被侵染烟株的提早清除等病毒防控工作打下了基础，积累的贵州烟区的数据也是我国花叶病研究的重要补充。
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