FAT1转基因系祖公牛选育及其扩繁研究
时间：2023-02-20 08:45:05 来源：千叶帆 本文已影响人
白春玲，杨磊，苏广华，魏著英，王学侨，朱琳，周新宇，海超，吴迪，刘雪霏，武云喜，张立，李光鹏
（内蒙古大学生命科学学院，省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，呼和浩特 010071）
研究表明，一些低等物种，如线虫、真菌和藻类，在合成LC-PUFA方面表现出良好的能力，许多研究者致力于培育新的或改良的物种，以将其作为合成LC-PUFAs和通过分子克隆进一步开发转基因动植物的来源[14-16]。在秀丽隐杆线虫中发现的FAT1基因编码脂肪酸脱氢酶，能够通过在甲基末端的第3个碳上添加1个双键而将n-6 PUFAs催化至n-3 PUFAs，在哺乳动物细胞中尚未发现此类酶。为提高n-3 PUFAs含量，研究者们尝试通过转基因方法生产富含n-3 PUFAs的家畜动物，迄今已获得了转FAT1基因猪[17-23]、牛[14-26]和羊[27-28]，且经检测，在转基因动物中n-3 PUFAs水平明显升高，n-6/n-3 PUFAs比值明显下降，说明FAT1转基因促进了n-6 PUFAs向n-3 PUFAs的合成，而且FAT1转基因通过上调参与多不饱和脂肪酸合成途径的酶基因表达，增强了n-3PUFAs的合成。
本实验室自2008年开始，以线虫来源的FAT1基因为靶标，在奶牛、肉牛和绵羊中开展转基因研究[24,27]，并于2009年成功培育出世界首例FAT1转基因奶牛，经检测转基因牛体细胞与奶汁中的n-3 PUFAs含量显著高于普通奶牛，n-6/n-3比值接近于1.0，而且奶牛的繁殖能力未受到明显影响[24]。同时用FAT1转基因牛的奶饲喂小鼠表明，转基因牛奶对小鼠的生理反应、生长繁殖能力以及肝脏和肾脏代谢均无不良影响[29]。本研究利用超数排卵与胚胎移植技术（multisuperovulation and embryo transfer，MOET）对 原 代FAT1转基因牛进行扩繁，获得F1代转基因牛；
在F1代牛中，选育出可用于品系培育的系祖公牛；
利用系祖公牛生产F2代转基因牛，分别对F1和F2代牛遗传稳定性、生长指标与血液生理生化指标进行分析，旨在获得FAT1转基因牛育种基础数据，以期为优质肉牛生物育种并为大众提供健康牛肉奠定基础。
1.1 饲养管理
转基因牛由原代转基因克隆牛[24]扩繁而来，同野生型牛一并养殖于内蒙古内大圣牧高科牧业有限公司牧场，全舍饲散养，用全混合日粮（total mixed rations，TMR）饲喂，每天7:00和17:00分别饲喂1次。TMR组成比例：青贮玉米62%、燕麦草2%、压片玉米2%、棉籽3%、高产精补料16%、围产料2%、中产精补料11%、苜蓿2%。
1.2 超数排卵与胚胎移植
以养殖于内蒙古内大圣牧高科牧业有限公司牧场的原代FAT1转基因牛ZK002为供体（已获批开展中间试验，备案报告号：农基安办报告字〔2020〕第220号），用于超数排卵。将投放牛用孕酮阴道栓（1.9 g·支-1，新西兰DEC国际有限公司）当天定为发情第0天，并在第9天开始超数排卵，采用连续4 d注射促卵泡激素（FOLLTROPINV，700 IU·瓶-1，加拿大Vetoquinol公司）进行超排处理，并在注射卵泡激素第3天同时注射氯前列醇钠注射液（兽药字110252207，10 mL·支-1，宁波第二激素厂），注射完最后1针后取出牛用孕酮阴道栓，第13天根据发情情况进行人工授精，所用精液为本牧场养殖公牛精液。在发情后的第7天采用非手术法冲胚，每个子宫角反复冲3~4次，镜检回收胚胎，并将回收胚胎移植于受体牛子宫中，发情开始后第60天进行妊娠检查。
1.3 转基因鉴定
提取待检牛血液基因组DNA进行PCR鉴定。设计合成FAT1基因PCR扩增引物，F1代鉴定：正向引物序列为5’-TCCAGCACTTTCTTCACGC-3’，反向引物序列为5’-TCAACGCCAACACCAAGC-3’，产物大小为942 bp；
F2代鉴定：正向引物序列为5’-AACTTGGATCCCTGGTTATTGTGCTGTCTCAT-3’，反向引物序列为5’-AACTTGCGGCCGCCTCATCACT TGGCCTTGG-3’，产物大小为1 258 bp。PCR反应程序：94℃5 min；
94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，30个循环；
72℃7 min，扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳中进行检测。
1.4 血液脂肪酸分析
取1 mL血清加入3 mL氯仿-甲醇溶液（体积比为2∶1），混匀，室温过夜；
1 500 r·min-1离心5min，取上清，氮气吹干；
正已烷500μL溶解，振荡2 min；
加入1 mL KOH-甲醇饱和溶液（35.5 g·L-1），剧烈振荡后，室温静置过夜；
1 000 r·min-1离心10 min，取上清，加入小玻璃瓶中，采用气象质谱仪（GCMS-QP2010 ultra，日本岛津公司）检测脂肪酸各组分的相对含量。
1.5 外源基因的组织表达检测
屠宰1头原代成年FAT1转基因母牛，分别取其心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪和脑等组织，以βactin为内参，分别检测各组织中FAT1基因的RNA表达情况。提取不同组织总RNA，反转录获得cDNA。反应体系为20μL：cDNA 2μL，SYBR PremixExTaq10μL，正反向引物（10μmol·L-1）各0.8μL，H2O 16.4μL。PCR反应程序：95℃30 s；
95℃5 s，60℃34 s，40个循环；
95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。
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继续围绕标准工作稳步推进，充分发挥标准对行业的发展支撑作用；
积极推动课题项目落地成熟，以问题为导向， 推动国密算法、节能技术在智能建筑领域的应用。
1.6 组织的脂肪酸分析
采用气相质谱仪分别分析了转基因牛肺、肝、心、脾、脂肪、脑、肾和肌肉组织中37种脂肪酸的含量，同时选取野生型牛相应组织作为对照。分别称取各组织0.5 g，置于F6/10-6G匀浆器（德国弗鲁克公司）中，加入3 mL氯仿-甲醇溶液（体积比为2∶1），研磨匀浆液，静置至分层为止；
收集上清液4℃保存，向剩余混浊液体加入2 mL氯仿-甲醇溶液（体积比为2∶1），混合均匀，室温静置过夜；
收集上清液，与第1次的上清液混合，在TTLDCII氮气吹干仪（北京同泰联科技）上吹干。收集沉淀，加入2 mL正己烷，完全溶解后加入400μL KOH-甲醇饱和溶液（35.5 g·L-1），剧烈振荡混匀2 min，静置10 min，取上清液-20℃保存。取700μL液体于上样瓶中，进行气相质谱分析。
1.7 生长指标测量
分别在转基因牛出生0、3、6、9、12、15、18月龄时测定生长性状指标，包括体质量、体高、十字部宽、胸围等，其中体高是指由肩胛骨凸起处到地面的相对高度，十字部宽是指两腰角间的水平距离，胸围是指肩胛骨处垂直周长。F1代FAT1转基因牛（公牛2头、母牛6头，转基因组）与野生型牛（公牛3头、母牛8头，对照组）比较；
F2代FAT1转基因牛（母牛6头、公牛6头，转基因组）与野生型牛（公牛4头、母牛7头，对照组）比较。
1.8 繁殖能力分析
①母牛繁殖能力分析：观察母牛初情期、性成熟期、发情周期及发情表现，并通过超数排卵的方式分析其对激素的反应能力，方法同1.2。②公牛精液品质分析：采用假阴道法采集成年健康转基因公牛ZK005精液，将稀释到合适密度的精液取10μL填充到通道载玻片上，然后放于Ni-U显微镜下（日本尼康公司），操作台恒温37℃。选择3个不同区域采用MICROPTIC精子分析仪（法国卡苏公司）分析精子活力，用Digitcool程序化自动冷冻仪（法国卡苏公司）冷冻精液，解冻时将细管冷精液从液氮罐里取出，置于室温10 s，之后将细管放于37℃恒温水浴锅中解冻10~15 s，待解冻后用酒精棉球擦拭细管，再用剪子剪开细管，将精液吹入含5 mL BO（Bracket and Oliphant）液的15 mL玻璃管中（BO液提前预热至少1 h），取10μL填充到通道载玻片上，放于显微镜下分析精子活力。
1.9 血液生化指标的测定
分别采集转基因牛和野生型牛颈部静脉血13 mL，3 000 r·min-1离心10 min，将获得的血清用C311生化分析仪（德国罗氏公司）测定血液生化指标，取300μL放入1.5 mL离心管中，置于分析仪样品转盘，用仪器自动分析输出数据。测定指标包括葡萄糖、肝功指标（碱性磷酸酶、谷氨酰转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、总蛋白、白蛋白、胆碱脂酶、肌酸激酶）、脂代谢相关指标（胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、脂肪酶）、肾功能指标（尿素、肌酐）及血液α-淀粉酶、乳酸和乳酸脱氢酶等。
1.10 数据分析
采用Microsoft Excel 2010进行数据处理和图形绘制，采用SPSS19.0软件进行显著性差异分析，数据采用平均值±标准差（xˉ±SD）表示。
2.1 F1代FAT1转基因牛生产效率
以FAT1转基因牛ZK002为供体，通过超数排卵与人工输精生产胚胎，再经胚胎移植获得胚胎23枚，移植入18头西门塔尔受体牛子宫；
60 d妊娠检查时，有14头妊娠，妊娠率为77.8%；
发育到期后，产下14头犊牛，产犊率为100%。经DNA鉴定，在14头犊牛中有8头为FAT1转基因牛（图1），阳性率为57.1%，其中2头公牛（ZK004、ZK005）和6头母牛（FD001、FD002、FD003、FD004、FD005、FD006）。
图1 F1代转基因牛FAT-1基因整合的PCR鉴定Fig.1 PCR identification of FAT-1 gene integration in F1 transgenic cattle
2.2 血液中不同脂肪酸水平比较
由表1可知，F1代FAT1转基因牛血液中n-3 PUFAs含量明显高于转基因阴性牛和野生型对照牛，n-6/n-3 PUFAs平均值显著低于转基因阴性牛和野生型对照牛（P＜0.01）。结果表明，外源FAT1基因在牛体内发挥生物学功能，可将n-6 PUFAs有效地转化为n-3 PUFAs。
表1 F1代FAT1转基因牛血液中脂肪酸组成Table1 Fatty acids composition in blood of FAT1 transgenic cattle in F1 generation
2.3 转基因牛不同组织中FAT1基因的表达和脂肪酸含量比较
分别检测了原代转基因牛各组织中FAT1基因的RNA表达情况，结果（图2）显示，FAT1基因在肺中表达最低，将其设定为1，依次分别计算出其他组织相对于肺组织的表达量，FAT1基因的RNA表达量由低到高依次为肺、肝、心、脾脏、脂肪、脑、肾脏和肌肉，其中肌肉中表达量是肺组织表达量的36.60倍。对各种组织的脂肪酸含量进行分析（表2）显示，与野生型牛相比，转基因牛各组织n-6/n-3 PUFAs比值均下降，表明FAT1在转基因牛体内能够表达并合成脂肪酸脱氢酶，有效地将n-6 PUFAs转化为n-3 PUFAs。
表2 不同组织中n-6/n-3PUFAs比值Table2 n-6/n-3PUFAsratioindifferenttissues
图2 FAT1在不同器官组织中的表达情况Fig.2 E xpression of FAT1 in different tissues
2.4 F1代FAT1转基因牛生长发育情况
对F1代转基因牛生长发育指标进行测量显示（表3），转基因组公牛和母牛0~18月龄体质量、体高、十字部宽和胸围与对照组牛差异均不显著（P＞0.05）。说明转FAT1基因后不影响宿主牛的正常生长发育。
表3 F1代FAT1转基因牛与野生型对照牛主要生长指标比较Table3 ComparisonofthemaingrowthindexesbetweenFAT1transgenicF1generationcattleandwildtypecontrolcattle
2.5 F1代FAT1转基因母牛繁殖能力
本研究先后获得F1代FAT1转基因母牛6头，观察发现转基因母牛初情期出现在10~13月龄，性成熟期为14~16个月，发情周期为21.0~22.5 d，发情表现为外阴部肿胀、黏膜充血、排黏液、接受爬跨或爬跨。母牛成年后，对其进行集中超数排卵、人工授精以生产胚胎。结果显示，在6头母牛中，其中1头连续同期处理2次均未表现明显的发情，也没有获得可利用的胚胎；
1头母牛对激素非常敏感，同等剂量的激素会引发其卵巢水肿，每次超排能够获得5~6枚胚胎，但仅有3枚可用，其余2~3枚卵子均没有受精；
另外4头牛发情效果与对照组无明显差异，平均每头获得良好胚胎6.5枚，其中有2头表现最好，每次均可得10枚以上的优质胚胎。比较发现，F1代FAT1转基因母牛的卵泡发育、排卵行为、受精能力、胚胎发育能力等均与野生型牛无明显差异。
2.6 F1代FAT1转基因公牛繁殖能力
分别将2头F1代FAT1转基因公牛命名为ZK004和ZK005，ZK004体况较弱，ZK005生长发育良好。ZK005公牛在13月龄时出现雄性表现，活跃兴奋，爬跨其他牛；
在16月龄时，开始对其采精训练；
到20月龄时，正式采精与冻精。精液分析表明，精液密度平均1.36×109·mL-1，鲜精活力为60%~70%，冻后活力为40%，各项指标均高于野生型公牛。
利用ZK005的精液分别与西门塔尔牛与鲁西黄牛进行配种，生产F2代FAT1转基因牛，获得17头犊牛，其中15头存活至周岁，存活率为88.2%。分别从F2代FAT1转基因牛的背最长肌采集肌肉组织，提取总RNA，进行RT-PCR检测。结果（图3）表明，在存活的15头牛中，FAT1转基因阳性牛12头（编号：190220、190221、1904051、1904052、190427、190429、190505、190506、190510、190623、190624和190630），阳性率为80%（12/15）。FAT1基因在12头牛的肌肉中均检测到目的条带，PCR产物大小为1258bp。说明FAT1基因在这些个体中均可以正常转录为mRNA。
图3 RT-PCR检测转基因F2代FAT1转基因牛组织中外源基因FAT1的表达Fig.3 RT-PCRdetection of the expression of FAT1 gene in transgenic F2 generation cattle
分别提取12头F2代FAT1转基因牛及ZK005的肌肉组织蛋白，通过Western blotting的方法检测蛋白表达情况。结果（图4）显示，所有组织样品中均可以检测到FAT1蛋白，说明FAT1基因在转基因牛中均可以稳定表达。
图4 FAT1转基因牛的Western blotting检测Fig.4 Western blotting detection of the FAT1 gene expression
2.7 F2代FAT1转基因牛的生长发育
对F2代FAT1转基因牛生长指标进行测量显示（表4），在同等饲养管理条件下，0~18月龄F2代FAT1转基因牛的体质量、体高、十字部宽、胸围等主要生长指标与对照组差异不显著（P＞0.05）。说明FAT1转基因对后代的生长发育不会产生显著影响。
表4 F2代FAT1转基因牛与野生型对照牛主要生长指标比较Table 4 Comparison of the main growth indexes between FAT1 transgenic F2 generation cattle and wild type control cattle
2.8 F2代FAT1转基因牛与野生型牛的血液生理生化指标
对获得的F2代FAT1转基因牛（转基因组）分别进行血液生理生化指标检测，并与野生型牛（对照组）的血液生理生化指标进行比较，由表5可知，转基因组牛除了个别时期个别指标出现差异外，在生产发育过程中血糖、肝功能、总蛋白、白蛋白、胆碱酯酶、肌酸激酶等指标均与对照组无显著差异（P＞0.05），但整体呈现略低于对照组的现象。脂代谢指标中，高密度脂蛋白胆固醇水平高于对照组牛（P＜0.05），而低密度脂蛋白胆固醇水平低于对照组牛（P＜0.05），总胆固醇水平低于对照组牛（P＜0.05），甘油三酯仅在15月龄显著高于对照组牛（P＜0.05），其他时期无显著差异（P＞0.05）。其他血液学指标中，转基因组牛肌酐、α-淀粉酶水平均低于对照组牛，乳酸脱氢酶水平均高于对照组牛，乳酸含量均低于对照组牛。以上结果表明，FAT1转基因牛对牛血糖、肝功能未产生显著影响，但影响了宿主牛的脂代谢，一些关键指标呈下降趋势，但均在正常参考值范围内，说明FAT1转基因对宿主健康方面未造成显著影响。
表5 F2代FAT1 转基因牛与野生型牛血液生化指标比较Table5 Comparison of blood biochemical indexes between FAT1 transgenic F2 generation cattle and wild type cattle 续表 Continued
表5 F2代FAT1 转基因牛与野生型牛血液生化指标比较Table5 Comparison of blood biochemical indexes between FAT1 transgenic F2 generation cattle and wild type cattle
现代生物育种技术包括转基因技术，能够加速育种进程，以达到精准育种的目的，培育满足不同需求的品种[30]。n-3 PUFAs与人类健康关系密切，利用转基因技术可将外源FAT1基因转入哺乳动物基因组，再通过转基因的动物性食品提供给人类必需的n-3 PUFAs。在前期工作中，本课题组获得了FAT1转基因牛并对其进行了功能性分析[24]，本研究则对其进一步扩繁，对F1代进行评价并从中选育系祖公牛以进行品系培育。
外源基因的稳定遗传和表达是转基因动物制备成功的重要指标[31]。本研究从原代牛经过MOET技术获得的F1代牛中，n-3 PUFAs显著升高，n-6/n-3 PUFAs比值由野生型的10.59～21.98降至8.38~1.12；
组织表达检测显示，FAT1在各种可食用组织中均有表达，其中肺部表达量最低，肌肉中表达量最高，其脂肪酸表达也呈相同趋势，脂肪酸中n-3 PUFAs所占比例提高，n-6/n-3 PUEAs比值下降，表明F1代牛中FAT1基因仍在稳定发挥生物学功能。外源基因的稳定遗传和表达与插入位点密切相关，本课题组在前期工作中已鉴定出原代牛FAT1基因插入到6号染色体NCAPG和LCORL之间的基因空白区域[32]。本研究获得的转基因牛后代性状表现良好，繁殖性能正常，遗传稳定性较好，表明这个区域是适合转基因的安全位点。
由于本研究前期获得的原代牛为母牛，为了品系培育考虑，如果要快速扩大核心群体，需要再选育性状优良的公牛作为系祖。系祖公牛要求有优良的性状、其后代要能稳定遗传优良性状。本研究中F1代公牛ZK005经基因组水平检测、功能鉴定和生长性状测定，表现出良好的性状，遗传稳定，功能表现良好，繁殖能力较好，且其后代遗传稳定性也较好，因此本研究将ZK005作为备用系祖公牛，用以进一步培育FAT1转基因牛。
本研究采用ZK005精液配种获得了F2代牛12头，FAT1基因稳定遗传并有效表达，通过生长指标测量和血液生化分析对其生长发育和健康状况进行评估。生长指标是品种培育的基本要求，FAT1转基因牛的生长发育与野生型牛一致，无显著差异，表明外源基因的转入没有影响生长进程。血液生理生化指标与动物健康状况密切关联，动物血液生理生化参数主要由动物自身的遗传因素与环境因素决定与控制。华文君等[33]对转sFat1-基因猪进行研究发现，转基因猪生理生化指标、繁殖性能、血液学指标均在正常范围内。本研究中，血糖水平在FAT1转基因牛与野生型牛中差异不显著，但是在生长过程中略低于野生型牛。机体中的血糖可以反映动物能量代谢水平，已有研究表明，饮食中如果缺乏n-3 PUFAs会增加机体患Ⅱ型糖尿病的风险[34]，n-3 PUFA通过影响细胞的胰岛素敏感性，增加葡萄糖转运体基因Glut4的表达，促进细胞吸收血液中的葡萄糖[35]。研究表明低n-6/n-3 PUFAs比值可以降低糖尿病患者胰岛素抵抗来改善糖代谢[36]。有研究者对FAT1转基因小鼠进行分析发现，FAT1表达引起n-3 PUFAs升高使血糖水平降低[37]。本研究中FAT1转基因牛能够改善糖代谢，与前人研究结果一致。生化指标可以反映机体的肝脏功能的变化情况，如果超出正常生理水平范围，则说明肝脏受到一定损伤的潜在可能。有研究者对FAT1转基因小鼠经高脂饮食诱导为脂肪肝进行研究发现，其肝脏的脂肪变性较野生型小鼠轻，对肝细胞的充气和纤维化症状有缓解作用，表明n-3 PUFAs对脂肪肝疾病的发生有保护作用[38]。本研究中，转基因牛肝功指标与野生型牛差异不显著，反映肝损伤的谷草转氨酶和谷丙转氨酶虽然有个别时期出现了差异，但是不具有损伤性；
且转基因牛中代表肝脏合成功能的总蛋白、白蛋白水平未发生明显变化，表明肝脏功能未受转基因的影响。血脂指标是衡量动物体健康的另一项重要指标，过高的血液胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇会导致动脉硬化等疾病的发生，而高密度脂蛋白胆固醇则能防止动脉硬化的发生，降低心血管疾病风险。研究表明，n-3 PUFAs可以促进胆固醇代谢为胆酸和中性固醇，形成胆汁后经粪便排出，因此能够有效降低胆固醇的水平[39-40]，n-3 PUFAs还能降低甘油三脂和低密度脂蛋白胆固醇的水平[41-42]。本研究中转基因牛血脂指标总体来说与野生牛无显著差异，只是在个别时期出现差异，但这些差异均是有益的变化，如胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇降低而高密度脂蛋白胆固醇升高。表明FAT1基因的转入与功能发挥对健康无不利影响。乳酸脱氢酶是糖酵解途径中的氧化还原酶，催化乳酸氧化为丙酮酸，引起乳酸脱氧酶升高的原因较多，如心肌梗死、急性肝炎/肝硬化等肝脏疾病、血液病、骨骼肌损伤等。本研究中，FAT1转基因牛与野生型牛相比，在部分生长阶段中血清乳酸脱氢酶水平升高，相应的乳酸水平降低，但均在参考值范围内[43]。
综上所述，FAT1基因的转入不影响牛的繁殖能力，后代牛能稳定遗传外源基因并发挥功能，健康状况未受显著影响；
由系祖公牛繁殖的转基因牛后代的各项指标均符合品系培育预期，因而利用系祖法培育FAT1转基因新品系或新品种具有可行性。本研究为培育优质肉牛奠定了基础，有望在将来为大众提供高营养价值牛肉。
