菌落总数测试片定量检测的方法验证
时间：2023-02-20 23:30:04 来源：千叶帆 本文已影响人
苏妙仪，严家俊，张 娟
（广东产品质量监督检验研究院，广东佛山 528300）
微生物检验是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定食品食用安全性的科学依据之一。我国国家卫生和计划生育委员会颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌3 项。菌落总数是指食品样品经过处理，在一定条件下培养后所得1.0 g 或1.0 mL 检测样品中所含细菌菌落的总数[1]。菌落总数是判定食品是否安全的重要指标之一[2]。微生物快速测试片法是直接将食品样液接种后于一定温度下培养，最终观察并计数的一种测定样品中微生物指标的方法[3]。与现有标准《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）相比，菌落总数定量测试片法无需配制培养基[4-5]，可有效降低实验误差[6]，操作简便快捷，检测时间短，适合户外操作，或将纳入国家标准检测方法。
目前，快速定量测试片主要分为滤纸、无纺布和冷水溶性凝胶3 种类型[7]。其中滤纸和无纺布虽然成本低廉，但保水性差，孔隙大，且菌落显色不清晰，给菌落计数增加难度[8-9]。而冷水可溶性凝胶透明、结构稳定、回收率高，易挑菌，更适用于微生物快速检测[10-11]。吴许文等[12]研究发现，冷水可凝凝胶测试片适合用于食品菌落总数检测，与国家标准测定方法结果无显著性差异。
本研究选择大肠埃希氏菌为测定菌，所使用的菌落总数定量测试片是一种预先制备好的一次性培养基产品，含标准营养琼脂、吸水凝胶和脱氢酶指示剂氯化三苯基四氮唑（TTC）。TTC 是一种氧化还原指示剂，水溶液无颜色。细菌在代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶可将无色的TTC 还原为红色的三苯甲臢，使菌落变成红色，通过红色菌点进行结果判定[13-14]。在6 类不同食品中进行加标，对比菌落总数定量测试片法和国家标准检测方法的测定结果，评价其测定的准确性和应用可行性，为研发适用于食品的新型快速微生物定量检测方法提供实践参考。
1.1 设备
HVA-85 高压灭菌锅：日本HIRAYAMA 公司；
1300 SERIES A2 生物安全柜；
DiluFlow 全自动电子稀释仪；
Bagmixer 400SW 拍打式均质器；
GHP-9160隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司。
1.2 材料与试剂
奶及奶制品、饮料、冷冻食品、肉制品、方便食品和宠物食品：客户送样；
平板计数琼脂：北京陆桥检测技术有限公司；
菌落总数定量测试片：某品牌有限公司。
1.3 标准菌株
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）：广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心。
1.4 方法
1.4.1 样品制备
选取6 种食品类别，每个类别选取5 种样品。分别取25 g（mL）样品于装有225 mL 灭菌生理盐水的均质袋中，用均质机混匀，配制成1∶10 的样品液，每个样品制备3 份同样的样品液。取1 mL 0.5 麦氏浓度的大肠埃希氏菌标准菌液加入上述1 份样品匀液中混匀，静置30 min 后，得到高浓度污染样品。再分别稀释100 倍和1 000 倍加入样品中，制备中浓度和低浓度污染样品。
1.4.2 样品接种
依据GB 4789.2—2016 的方法，选择2～3 个适宜稀释度的样品液进行实验。分别吸取1 mL 样品液接种于菌落总数测试片及国标检测方法平皿中，每梯度进行5 个重复。
1.4.3 培养与结果观察
菌落总数测试片置于（36±1）℃的恒温培养箱中培养24 h 后观察结果，选取菌落数30～300 CFU 的定量测试片进行结果判定。平皿按国家标准检测方法，于（36±1）℃恒温培养48 h 后观察结果。
1.4.4 统计方法
对菌落总数测试片和国标检测方法测得的菌落总数结果的符合率、相关性和差异性进行汇总分析。试验数据均用EXCEL 软件和SPSS19.0 软件进行处理。
2.1 菌落测试片与国家标准检测方法检测结果比较
将30 份样品分别经过高、中、低浓度污染后进行接种，计算生长率PR，并分析符合率[15]。菌落总数定量测试片方法与国家标准检测方法结果的生长率均≥0.7（图1），符合率达100%，可认为两种方法检测结果是一致的，菌落总数定量测试片方法能满足食品样品的检测需求。
此外，菌落总数定量测试片在不同种类食品中检测效果也有所不同。由图1可知，奶制品与宠物食品在高、中、低不同浓度大肠埃希氏菌污染下检测的菌落总数生长率接近，且在中和低污染浓度下检测结果更趋向于1.0；
肉制品在低的污染浓度下生长率趋向于1.0，中、高浓度时两种检测结果基本一致；
饮料、冷冻食品和方便食品在3 个污染浓度下检测的生长率在1.0～1.2。总体而言，在6 类食品的测试中，菌落总数定量测试片方法与国标检测方法测定效果有较好的一致性。此外，不同基质样品在菌落总数定量测试片均长出鲜红色菌点，清晰可见，有利于菌落区分，计数时长可缩短1/2，有效提高工作效率。
图1 菌落总数测试片法与国家标准检测方法生长率比较(n=5)
2.2 菌落总数定量测试片法与国标检测方法的相关性分析
根据样品接种试验结果，以菌落测试片结果对数值log(CFU·g-1)为横轴（x），以国标检测方法结果对数值log(CFU·g-1)为纵轴（y），分别绘制不同类别食品样品的拟合曲线。6 类样品的回归方程和决定系数分别如图2所示，R2均大于0.999 0，不同类型样品菌落测试片法与国标检测方法的检测结果均为强相关，即两种方法的变化趋势非常一致。
图2 菌落总数测试片法与国标检测方法检测结果的线性关系
2.3 菌落总数定量测试片与国标检测方法的差异性分析
使用SPSS 软件，采用单因素方差分析菌落测试片法与国标法的差异性。如表1所示，不同类型样品的F值均小于Fcrit，且P＞0.05，说明菌落测试片检测结果与国标检测方法测定结果无显著性差异，两者检测结果基本一致。
表1 菌落总数测试片法与国标检测方法差异性分析(n=5)
本研究通过比较菌落总数测试片法与GB 4789.2—2016 对6 种不同类别食品菌落总数的检测，探索测试片法在快速检测食品中菌落总数领域的应用可行性。结果表明，采用菌落测试片法具有快速、简便、结果便于判定等优点；
在菌落计数方面，时长可缩短一半，能够有效提高工作效率。与国标检测方法加标检测结果一致，准确性好，检测结果无显著性差异。在实际检测工作中，可根据检测环境、设备配置情况及样品的特性选择合适的方法，既可提高检测效率，又可确保检测结果的准确性。
