抗鸡球虫病基因重组疫苗的研究进展
时间：2023-02-22 11:55:07 来源：千叶帆 本文已影响人
邱茜茜，戚南山，李 易，李 娟，廖申权，吕敏娜，蔡海明，林栩慧，胡俊菁，肖文婉，张健騑，张 旭，孙铭飞*
(1.佛山科学技术学院，广东佛山 528231；
2.广东省农业科学院动物卫生研究所，岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东广州 510640)
鸡球虫病(Avian coccidiosis)是由顶复门(Apicomplexa)孢子纲(Sporozoasida)艾美耳科(Eimeriidae)艾美耳属(Eimeria)的多种球虫引起鸡的一种肠道原虫病，球虫主要寄生于鸡的肠上皮细胞内，初次在禽类肠道发现距今已有100多年历史，其对鸡的危害十分严重。鸡球虫病在世界各地均有发生每年造成的全球经济损失超过35亿美元[1]。鸡感染球虫后会表现出血性、坏死性肠炎和血痢等症状[2]。同时，球虫的亚临床感染也十分常见，多影响食物转化率、平均日增重和出栏时间等关键生产参数。
目前鸡球虫病的防控主要依赖化学抗球虫药、活卵囊疫苗和饲养管理等策略。随着抗鸡球虫病药物的大量使用，耐药虫株日渐增多，药物残留等弊端也日益明显，大大限制了抗鸡球虫病药物的应用[3]。免疫预防在后抗生素时代逐渐成为控制鸡球虫病的替代方法。目前的抗鸡球虫病疫苗主要以强毒或减毒活卵囊疫苗为主，但二者都存在一定的缺陷[4]，强毒活卵囊疫苗不适当的使用可能会导致球虫病暴发或将新的强毒球虫虫株引入养殖场，而弱毒活卵囊疫苗存在毒力返强的风险；
此外，所有活卵囊疫苗的应用都属于感染性免疫，存在影响免疫鸡体肠道健康的潜在危机。因此，新一代安全高效的球虫防控策略亟待改善。
随着各种基因工程技术的发展，疫苗研究的方向正逐渐从传统灭活苗和弱毒苗向基因工程疫苗过渡。目前正在研发或已应用于生产实践的基因重组疫苗主要包括核酸疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗和合成肽疫苗等[5]。与传统疫苗相比，基因重组疫苗具有安全、稳定、高效、易于制备等特点。在本综述中，总结了现有的抗鸡球虫病措施，探索了可用于重组抗鸡球虫病疫苗的候选方案。
1.1 抗鸡球虫病药物
大量研究表明，药物仍是防治球虫病的主要措施与手段。当前抗鸡球虫病药物(表1)包括聚醚类离子载体抗生素、化学合成药[3]及中草药。
表1 常用抗球虫药
聚醚类离子载体抗生素由放线菌(Actinomaduraspp.)或链霉菌(Streptomycesspp.)发酵产生，主要作用于球虫无性繁殖与有性繁殖阶段，通过干扰球虫细胞内阳离子的正常交换，破坏细胞内外渗透压，致使细胞死亡。由于其具有广谱抗鸡球虫病作用，被广泛应用于养鸡业。
化学合成类抗鸡球虫病药主要通过抑制球虫线粒体呼吸作用、干扰球虫二氢叶酸的合成或竞争性抑制硫胺摄取等方式来阻滞球虫的正常发育。
近年来，球虫对聚醚类抗生素和化学药物的耐药愈发普遍。研究发现，我国各地的柔嫩艾美耳球虫对聚醚离子载体类抗生素和化学抗鸡球虫病药物呈现不同程度的耐药性[6]。黄仪娟[7]等通过对分离得到的6株鸡艾美耳球虫虫株进行耐药性试验，发现6株虫株均呈现中度或重度耐药。
尽管抗鸡球虫病药物在鸡球虫病的防控中发挥着巨大作用，但不可避免的耐药性问题以及当前全面减抗替抗背景下对抗鸡球虫病药物使用的限制，消费者对食品中化学残留物的担忧，阻碍了大多数抗鸡球虫病新药的开发。
1.2 活卵囊疫苗
艾美耳球虫活卵囊疫苗由未减毒或减毒的艾美耳球虫虫株研制而成，可以有效替代化学药物用于预防鸡球虫病，鸡在摄入和循环受控剂量的疫苗卵囊后，可以获得坚强的免疫保护[8]。由于疫苗株的生产需要通过在鸡中独立传代多次，抗鸡球虫病疫苗在家禽业的应用受到了很大限制。对于生产能力的高要求，也意味着疫苗成本远高于抗鸡球虫病药[5]。
活卵囊疫苗也存在一定的缺陷。接种疫苗有引入新虫株的风险；
活卵囊会引起鸡轻微肠道病变，影响饲料转化率；
由于球虫卵囊较大，易沉积，添加悬浮剂后若不混匀，极易造成免疫不均，影响免疫效果。在免疫期间禁止使用抗球虫药，饲料中也不能含有抗球虫药物。以上因素的存在限制了球虫疫苗在养殖户中的广泛应用。
1.3 基因重组疫苗
基因重组疫苗主要有核酸疫苗、亚单位疫苗和活载体疫苗等 。核酸疫苗是将含有编码抗原基因序列的质粒载体，通过肌肉注射或用基因枪等导入宿主体内，被宿主的组织细胞、抗原呈递细胞或其他炎性细胞摄取，抗原蛋白在宿主细胞内表达，诱导产生特异性免疫应答，从而达到防治疾病的目的[9]。亚单位疫苗是通过基因重组技术，调取病原微生物保护性抗原基因并导入表达系统，在其高效表达后提取保护性抗原，加入佐剂制成的重组亚单位疫苗[10]。CoxAbic是第一个商业化的球虫病亚单位疫苗。由从巨型艾美耳球虫(E.maxima)分离到的亲和纯化的配子母细胞抗原(affinity purified sexual stage (gametocyte) antigens,APGA)组成[11]。接种蛋鸡后其抗球虫作用可通过蛋垂直传播给下一代。活载体疫苗主要是利用分子生物学手段，将目的抗原的编码基因导入细菌或病毒活载体，随着重组菌(毒)株在宿主体内增殖，目的基因大量表达，从而诱发相应的免疫保护应答[12]。自20世纪80年代有关于重组疫苗开发的报道以来，多个研究小组已经尝试和试验了多种候选抗原。据报道，在免疫球虫抗原重组蛋白、重组球虫抗原DNA疫苗及联合病毒活载体的球虫抗原疫苗的小规模试验中，球虫卵囊计数或肠道损伤评分降低了30%～90%，或者在饲料转化率或相对增重率方面得到了改善[13]。
当前抗鸡球虫病基因重组疫苗的研究主要集中于抗原蛋白的选择与细胞因子佐剂的联合使用。同时，艾美耳球虫复杂的抗原多样性对基因重组疫苗的研制造成了一定的阻碍，选择合适的抗原是开发新型基因重组疫苗的关键。
2.1 候选抗原蛋白分子研究进展
在宿主与虫体互作中发挥重要作用的蛋白被确定为抗鸡球虫病疫苗候选蛋白，这是由于这些蛋白在球虫入侵与增殖过程中自然暴露，因此可以作为宿主免疫应答的靶标[10]。
研究最广泛的是微线体蛋白，微线体位于顶复门寄生虫顶端，可分泌顶膜抗原(apical membrane antigen,AMAs)、微线体蛋白(microneme proteins,MICs)等，对寄生虫的滑行运动与黏附宿主细胞以及进出受感染细胞至关重要[14]。MICs在入侵早期分泌，帮助寄生虫附着于宿主细胞，为入侵创造平台[15]。对柔嫩艾美耳球虫的蛋白质组进行分析，发现AMAs蛋白在子孢子阶段和裂殖子阶段均存在。研究发现AMA1是子孢子入侵宿主的关键蛋白，是形成虫体与宿主细胞间环形运动结合体(moving junction,MJ)不可缺少的一部分[16]。
SO7蛋白又称RB1或GX3262，位于子孢子折光体上，作为重组蛋白、核酸疫苗或以鼠伤寒沙门氏菌为载体时，可诱导部分保护性免疫。研究发现柔嫩艾美耳虫重组折光体蛋白EtSO7能有效诱导免疫鸡产生细胞和体液免疫反应，对盲肠感染球虫的鸡有明显的保护作用[17]。
TA4蛋白位于柔嫩艾美耳球虫子孢子表面，研究发现抗TA4抗原的单克隆抗体会对鸡球虫子孢子入侵细胞产生抑制作用，表明TA4抗原可能在球虫入侵宿主细胞过程中发挥重要作用[18]。近年来大量研究也证实，以 TA4 基因编码的蛋白免疫鸡只，能够收到良好的抗球虫效果。IMP1定位于子孢子细胞膜，现已作为候选抗原被广泛研究。近年来，IMP1蛋白被先后确定为巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的疫苗候选分子[19-20]。3-1E蛋白是研究最多的抗鸡球虫病亚单位疫苗抗原。其主要与肌动蛋白单体结合，延缓肌动蛋白聚合作用，同时也在弓形虫的滑行运动中发挥重要作用。它还是Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)5、11和12的配体，这些受体在许多胞内病原微生物(如弓形虫)的免疫反应中发挥关键作用[21]，这表明3-1E蛋白可作为一种新的黏膜佐剂。研究发现免疫艾美耳球虫3-1E蛋白增强了小鼠对急性静脉病毒感染的抵抗力[22]。将艾美耳球虫3-1E蛋白、产气荚膜梭菌NetB蛋白与Montanide IMS佐剂联合应用，在巨型艾美耳球虫和产气荚膜梭菌共感染动物试验中，增强了对于坏死性肠炎的抵抗效果[23]。
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)作为无氧糖酵解途径的末端酶，对寄生虫在宿主体内的生命活动有较大影响。研究表明，每种球虫仅有一种LDH，因此常被用以鉴别艾美耳球虫虫种。分析柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)和堆型艾美耳球虫(E.acervulina)的LDH氨基酸序列，发现其同源性为66%～80%，且其蛋白表达水平在球虫发育各阶段无明显差异，具有作为疫苗候选抗原的潜力[24]。
2.2 细胞因子佐剂研究进展
细胞因子具有广泛的生物学活性，在调节固有免疫和获得性免疫中发挥着关键作用，由抗原或其他刺激剂诱导多种细胞产生。大量研究表明将细胞因子作为佐剂与球虫疫苗联合使用，可以调节免疫细胞活性，增强疫苗的免疫保护力和机体的免疫水平。通过将球虫保护性抗原与相应细胞因子连接构建表达载体，可以有效改善基因重组疫苗的缺点。
白介素(IL-2、IL- 12、IL-18)、干扰素(IFN-α、IFN-γ)和肿瘤生长因子(tumor growth factor,TGF)b4等被广泛用作基因重组疫苗的佐剂。在加入IFN-α和淋巴细胞趋化因子后，感染堆型艾美耳球虫鸡的饲料转化率得到了显著提高，而IL-1β、IL-8、IL-15、IFN-γ、TGFb4和淋巴细胞趋化因子则可降低球虫的复制。细胞因子的剂量和类型也会影响局部免疫反应的质量。研究表明，联合注射pcDNA3.1-IL-2重组质粒对鸡球虫疫苗免疫具有增效作用[25]。近年来，IL-2被证实可与多种艾美耳球虫抗原相结合，如TA4、SO7以及堆型艾美耳球虫抗原cSZ-2，表明IL-2的联合应用可增强基因重组疫苗诱导的免疫保护效果。
2.3 抗原多样性
了解球虫基因组遗传多样性的程度与研究其野外生存和进化能力高度相关。在外界选择压力的变化下，适应的速度对球虫的生存至关重要，常受到遗传多样性的影响。Emily等[26]对248条来源于堆型、巨型和柔嫩艾美耳球虫的ITS1-5.8S-ITS2序列的固定系数(FST)进行了比较，结果表明其存在显著的种内多样性，其中柔嫩艾美耳球虫可能存在地域差异。艾美耳球虫的遗传多样性和复杂的生命周期使基因重组疫苗的研制成为一项艰巨的任务[27]。
迄今为止，各界学者仅对少数艾美耳球虫的候选疫苗抗原进行了详细的序列分析以确定其多样性。研究发现，当巨型艾美耳球虫顶膜抗原EmAMA1作为DNA疫苗或细菌载体重组蛋白疫苗进行免疫时，可诱导强大的同源免疫保护作用[19]。此外，对来自中国、埃及、德国、印度、日本、利比亚、尼日利亚、英国、美国和委内瑞拉的56份柔嫩艾美耳球虫现场样本的EtAMA1编码序列分析显示，该样本存在中度多态性，与柔嫩艾美耳球虫的全基因组多样性形成鲜明对比[28]，说明AMA1是一种良好的候选疫苗抗原。李灵娟[29]通过分析从毒害和堆型艾美耳球虫中克隆到的NA4和3-1E抗原基因，发现NA4抗原与柔嫩艾美耳球虫的TA4抗原之间基因序列的同源性达91.4%，氨基酸序列的同源性为86%；
3-1E抗原在柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫之间的基因序列同源性达99.8%，氨基酸序列的同源性为99.4%，动物交叉免疫保护试验证明两种抗原对4种艾美耳球虫均有部分交叉免疫保护作用，说明这2种抗原有可能作为艾美耳球虫交叉免疫保护性DNA疫苗的候选抗原。
抗原多样性会影响针对顶复门原虫如恶性疟原虫的实验性疫苗的效力。由抗原多样性导致的免疫逃避在堆型、巨型、和缓以及柔嫩艾美耳球虫中均有发现。因此，详细了解编码候选疫苗抗原的基因多样性是选择最优候选疫苗抗原的关键。
3.1 免疫途径
由于免疫途径不同，参与免疫应答的效应细胞也不同，可能会对疫苗的免疫保护效果造成一定影响。免疫途径的选择应考虑多方面的因素，如接种部位细胞呈递抗原的能力、细胞的转染效率、抗原基因的体内表达水平和宿主易感性等。基因重组疫苗的免疫途径主要有注射、口服、点眼滴鼻、喷雾、电穿孔和基因枪技术等。研究发现，核酸疫苗腿部肌肉注射的效果最优，且抗鸡球虫病指数最高[30]，说明肌肉注射是一种简单有效的免疫途径。若以志贺氏菌、沙门氏菌、李斯特氏菌作为球虫基因重组疫苗的载体，可采用口服免疫、鼻内滴注或鼻腔喷雾等方法提高粘膜免疫应答，但存在一定局限性。
3.2 免疫剂量
免疫应答强度和免疫保护力与免疫剂量有关。周赛等[31]将柔嫩艾美耳球虫Mic4-N端蛋白在重组酵母中表达，与AbISCO©-100佐剂结合后进行动物试验，发现10 μg蛋白+50 μg佐剂组CD4+T、CD8+T淋巴细胞百分率显著升高，增重显著升高，肠道病变计分、粪便OPG值显著降低，证明免疫剂量是影响抗球虫效果的因素之一。赵胜杰[32]制备了针对多种艾美耳球虫的混合DNA疫苗，其中柔嫩艾美耳球虫的最佳免疫剂量为10 μg，而另外3种球虫的最佳免疫剂量均为25 μg，说明对于不同种的艾美耳球虫，疫苗的最佳免疫剂量也不相同。
3.3 免疫次数
由于基因重组疫苗在体内表达量低、持续时间长的特点，免疫次数对免疫效果有很大影响。李祥瑞等[33]将含有生长激素基因的质粒导入小鼠表皮细胞后，88%的被免小鼠产生了抗体，二次加强免疫后抗体水平明显提高。顾有方等[34]研究了GC02鸡球虫病疫苗的免疫保护效果。结果显示，二次免疫的效果最优，可有效控制鸡球虫病的发生，且能明显促进雏鸡的生长。说明在初次免疫后，再次或多次加强免疫，可有效提高体液免疫或细胞免疫应答水平。
近年来，随着公众对食品安全的重视以及病原耐药性的问题，疫苗已代替药物成为球虫病防控的流行趋势。相较于活卵囊疫苗，基因重组疫苗制作成本更低，可诱导机体产生高水平保护性免疫，已成为当前研究热点。不同发育阶段的球虫，其抗原组成与免疫原性也不同，因此，将不同球虫保护性抗原基因连接到表达载体中，构建多价多表位基因重组疫苗将是未来基因重组疫苗研究的趋势。此外，利用细胞因子构建免疫调节型基因重组疫苗可以提高抗原呈递效率，增强免疫效果，具有较好的应用前景。
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