微重力环境下肢体废用性萎缩对于软骨细胞外基质成分和表型分化的作用研究
时间：2023-02-22 14:55:05 来源：千叶帆 本文已影响人
曲彦隆 刘思遥 南 飞 刘禄萌 闫 谨
(哈尔滨医科大学附属第一医院骨科,黑龙江 哈尔滨 150001)
随着航天事业的发展,越来越多的航天员进入太空。在复杂的航天环境中,人体始终处于微重力状态,返回地球后往往出现骨质疏松、肌肉萎缩、关节疼痛及功能障碍等并发症[1-2]。因此,长时间太空航行后,航天员必须在专业医护人员的搀扶下离开返回舱,并且康复过程漫长。目前在微重力环境下,关节软骨损伤作为膝关节疼痛及功能障碍的重要原因,少有报道。膝关节软骨作为承重软骨,对于生物力学负载的变化非常敏感[3]。在太空微重力环境中,航天员的作业多通过上肢来完成,下肢长期处于去负载的状态。而软骨组织其中缺乏血管、淋巴与神经组织,一旦损伤就难以修复,逐步发展为不可逆的损伤。还会进一步产生膝关节不稳定,代偿性结缔组织改变等问题,最终导致膝关节的疼痛和活动受限。随着软骨细胞的受损,一些碎屑及化学物质会被释放,从而导致膝关节疼痛逐渐加重[4],上述变化的最终结果就是膝关节骨性关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)[5],对航天员的关节健康造成不可挽回的严重后果。因此我们认为,如何预防关节软骨损伤比治疗更重要。通过研究软骨组织在微重力环境下受到的去负载损伤,减轻航天员回归后的膝关节疼痛与活动障碍,加速航天员的康复,避免KOA的发展。本研究对微重力环境下的软骨细胞形态学和细胞外基质内MMP-13及II型胶原等成分进行了对比和分析,现报告如下。
1 一般资料
1.1 实验动物:4周龄SD大鼠30只,雌雄不限,60-75g。由哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心提供。
1.2 实验仪器:分析天平(Mettler toledo公司,中国),Odyssey红外光扫描成像系统(LI-COR公司,美国),倒置显微镜(Leica公司,德国),恒温细胞培养箱(Binder公司,德国),低温离心机、高速离心机(Beckman coulter公司,美国)。
1.3 实验试剂:DMEM-F12培养基(大连美仑生物技术有限公司),0.25%胰蛋白、Ⅱ型胶原酶(GIBCO公司,美国),Bradford蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术公司),青-链霉素双抗(Hy-Clone公司,美国)。
2 实验方法:软骨细胞分离、培养及鉴定。
2.1 软骨细胞分离:选取实验大鼠,无菌条件下分离软骨组织,将软骨切成1mm3大小的组织块。PBS冲洗后加入II型胶原酶,置于DMEM培养基中进行培养、消化、过滤、离心,在培养基中重悬细胞,随后接种于培养皿中,37℃恒温,5%CO2浓度,饱和湿度,进行培养。
2.2 软骨细胞传代培养:吸去培养基后PBS漂洗干净,加入胰蛋白酶进行消化,离心。加入DMEN培养基,将均匀悬液中的细胞接种于2个培养皿中,按照上述条件继续培养,传代。第3代细胞用于实验。
2.3 微重力环境下软骨细胞生长检测:取P3代大鼠软骨细胞,正常重力软骨细胞组、正常重力关节炎软骨细胞组、微重力软骨细胞组、微重力关节炎软骨细胞组。利用双向多样本细胞微重力培养装置,于转速30rpm/min、温度37℃,培养72小时,提供微重力环境。关节炎软骨细胞则采用10ng/ml IL-1β诱导48小时造模,倒置相差显微镜下观察各组软骨细胞,记录生长情况与形态变化。
2.4 Western blot检测:2组取部分软骨组织。加入RIPA裂解液,4℃条件下裂解1小时。裂解完成后,将各样本上机酶标仪测量蛋白浓度。根据BCA蛋白测定的结果,向齿槽中加入适量的蛋白,观察溴酚蓝的移动情况。将制备完成的PVDF膜在摇床上封闭1-2小时,并加入一抗,4℃环境下摇床上孵育12小时。吸取一抗,静置1小时,随后用TBST洗涤3×10分钟。加入二抗,4℃环境下摇床上孵育2小时。在暗室中取出孵育后的PVDF膜,洗涤后置于成像分析仪中进行成像,软骨细胞表型相关蛋白MMP13、II型胶原的表达情况。
3 统计学方法:使用SPSS26.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用均值±标准差(s)表示,若数据呈偏态分布,以中位数(4分位数)表示;计数资料以例数、百分比(n,%)表示。组间计量资料比较采用单因素方差分析,3组以上两两比较采用t检验,多组间计量资料比较采用单因素方差分析,方差不齐时采用秩和检验。计数资料比较采用卡方(x2)检验。正态分布的计量资料间的相关性分析采用Pearson相关,非正态分布采用Spearman相关。P〈0.05认为有统计学意义。
4 结果
4.1 镜下观察软骨细胞,可见软骨细胞集落样生长,多层重叠,基质分泌充足(见图1A、图1B),可见典型铺路石样改变。与哈尔滨工业大学合作,利用双向多样本细胞微重力培养装置,于微重力环境下行软骨细胞传代培养,镜下观察,相对于地面组可见软骨细胞形态不规则,排列紊乱,界限模糊,典型铺路石样表现缺如(见图1C、图1D)。
图1 微重力下软骨细胞失去典型铺路石样改变。(40×)(A)地面骨关节炎组;(B)地面正常软骨组;(C)微重力骨关节炎组;(D)微重力正常软骨组。
4.2 微重力环境下可促进正常软骨和关节炎软骨中的MMP-13与II型胶原的表达。MMP-13及II型胶原的测定在地面组和微重力组相关蛋白表达结果如下(见图2)。结果显示,无论是正常软骨还是关节炎软骨,MMP-13及COL-II的相对蛋白水平均为微重力组明显高于正常地面组,说明微重力下软骨细胞的ECM合成与分解活动增强(P〈0.05)。
图2 Western blot法测定地面及微重力环境下正常软骨和关节炎软骨中的MMP-13、II型胶原的表达。无论是正常软骨还是关节炎软骨,MMP-13及II型胶原的相对蛋白水平均为微重力组明显高于正常地面组。
微重力环境改变了正常膝关节面之间的应力分布。根据Fitzgerald J等人的实验结果表明,小鼠软骨组织厚度在30天的太空航行后减少将近1/3[6]。而长时间的去负载状态会导致软骨组织胶原降解、蛋白聚糖含量明显减少[7]。不同频率、不同张力的机械负荷对软骨细胞增殖分化的影响不同。过强或者过弱的机械负荷会上调炎性因子表达,导致关节软骨细胞外基质分解增加、合成水平下降,软骨细胞的表型被破坏,甚至出现骨关节炎的相关征象。而适宜的机械负荷能够通过给予软骨细胞机械刺激促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化[8],促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成,对软骨细胞表型维持有着积极的影响[9-10]。本实验论证了微重力环境下培养的软骨细胞形态较不规则,排列紊乱,界限模糊,失去了典型的“铺路石样”表现。且Western blot结果显示,能够分解关节软骨细胞外基质成分的关键因素MMP-13的表达也因微重力环境而上调。这与上述研究结果较为一致。针对于本实验微重力环境下有助于软骨细胞的增殖培养、表型维持则更多的可能是微重力环境下悬浮培养模式和正常软骨细胞传代培养模式的不同所导致的结果。我们后续希望通过在体实验构建大鼠的肢体废用性萎缩去负载模型,更加完备的模拟微重力环境对于膝关节内部静水压和应力分布的影响,从而更加深入细致的探究微重力下肢体废用性萎缩导致软骨损伤的具体机制。
猜你喜欢 胞外基质胶原软骨 黄芪对细胞毒素相关蛋白A 诱导的大鼠系膜细胞外基质分泌的影响医学信息(2022年15期)2022-09-09SOX9在SD大鼠胚胎发育髁突软骨与胫骨生长板软骨中的时间表达研究昆明医科大学学报(2022年2期)2022-03-29黑鱼胶原溶液的流变、热稳定性及化学交联改性研究皮革科学与工程(2022年1期)2022-01-15基于“土爰稼穑”探讨健脾方药修复干细胞“土壤”细胞外基质紊乱防治胃癌变的科学内涵中国中医药信息杂志(2022年1期)2022-01-13脱细胞外基质制备与应用的研究现状感染、炎症、修复(2021年1期)2021-07-28有关髁突软骨损伤治疗的研究进展世界最新医学信息文摘(2020年45期)2020-12-25运动对衰老的骨骼肌中MMPs及TIMPs的影响当代体育科技(2017年32期)2017-11-27响应面法优化可口革囊星虫胶原抗氧化肽的制备研究食品工业科技(2014年13期)2014-03-11末端病大鼠跟腱修复中胶原表达的研究体育科研(2013年2期)2013-05-31运动对肌腱中胶原代谢影响研究进展哈尔滨体育学院学报(2010年3期)2010-12-08 相关热词搜索：表型，基质，软骨，
