转化生长因子β1与支气管肺发育不良关系的研究进展
时间：2023-02-23 20:15:07 来源：千叶帆 本文已影响人
张娟丽 韩亚梅 王凡
支气管肺发育不良（Bronchopulmonary dysplasia，BPD）是由于早产儿肺发育不成熟和出生前后自身或外界因素共同作用（如高氧、感染、机械通气等）导致的肺和支气管的异常发育。随着新生儿医学研究的深入以及围产辅助生殖水平的提高，早产儿存活率明显升高，尤其是超早产儿，故使得BPD的发病率增高。胎龄22～28周超早产儿近40%有发展为BPD的风险，是死亡和长期呼吸、神经发育残疾的主要儿科就诊原因[1]。临床上引起BPD的病因较多，不同病因引起的BPD病理生理改变、临床表现及预后不同[2]。新旧BPD的病理改变不同，旧BPD主要影响晚期早产儿，表现为肺泡结构损伤、炎症细胞浸润、气管平滑肌增生及间质性改变引起的肺囊性病变及纤维化为主。而新BPD主要病理变化为肺发育不成熟，在外界因素的影响下，导致肺泡发育停滞、肺泡减少及简单化、异常毛细胞血管发育和血管组织异常生长[3]。因BPD的发病机制目前仍不清楚，保护性治疗措施在改善BPD中的临床效果仍欠佳，故寻找参与BPD过程中的主要信号通路，为BPD提供靶向治疗位点迫在眉睫。
TGF-β1是TGF-β超家族中的一员，在哺乳动物中仅存在3个亚型，分别是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，这3个亚型具有70%～82%的氨基酸同源性[4]。TGF-β1由人体中TGF-β基因编码，位于染色体19q3[5]，通过二硫键将2条各含112个氨基酸的单链结合，是一种相对分子质量为25 000的多肽，具有调节细胞增殖、分化及迁移、凋亡、细胞外基质合成和免疫抑制等多种生物学功能，主要在内皮细胞、造血细胞和结缔组织细胞中表达[6]。TGF-β1只有通过与相应受体结合，才能发挥相关生物效应，而与TGF-β1结合的受体有3种，分别是TGF-BRⅠ、TGF-BRⅡ及TGF-BRⅢ。而TGF-β的这3种亚型均与TGF-β2型受体作为同型二聚体结合，招募并激活TGF-β1型受体以启动受体信号[7]。
2.1 TGF-β1与血管形成大部分肺的发育发生在肺泡发育期，通过“二次间隔”使得厚壁囊状气道变为小的薄壁肺泡，肺毛细血管通过血管生成而扩张，增加肺的气体交换面积。由于早产儿，特别是超早产儿和极早产儿的肺发育不成熟且抵抗力低，对氧气依赖性高，同时大多数患儿需要不同程度的机械通气等相关外界因素干扰，导致肺的发育受损，肺泡结构简单化及微血管受损，引起BPD[8，9]。肺血管生成是肺泡化的关键驱动因素，内源性NF-κB活化具有促进早期肺泡的肺血管生成，但激活NF-κB的机制尚不清楚。现有研究表明，TGF-β1是肌成纤维细胞在早期肺泡化中高度表达的分泌蛋白，为一种发育调节蛋白，激活肺内皮（PEC）中NF-κB，并通过整合素αvβ3增强NF-κB介导的内皮细胞（EC）迁移，促进肺内血管形成，而TGF-β1表达失调可能导致肺泡受损，分隔破坏及血管生长受损[10]。TGF-β1表达失调还可能导致在肺泡化受损的情况下，观察到异常血管形成，说明TGF-β1是早期肺泡化过程中维持内皮NF-κB活性的关键因素。而TGF-β1介导的NF-κB活化和PEC迁移取决于其结合整合素的能力。αvβ3在新生血管中高度表达，αvβ3的激活促进EC的迁移，阻断αvβ3可阻碍胚胎中血管管腔形成和血管模式[11]。研究表明TGF-β1通过整合素αvβ3促进人脐带ECs的黏附和迁移[12]。TGF-β1促进血管形成的下游机制是集落刺激因子3（Csf3），Csf3是一种NF-κB的靶基因，编码G-CSF，可导致内皮一氧化氮合酶（eNOS）的表达，以增加NO的产生，使eNOS缺失的小鼠肺毛细血管形成受损[13]。这是由于NO是血管生成的关键调节剂，也可维持血管的稳态，eNOS表达减少可导致NO生成减少，临床上利用iNO预防BPD的研究结果与其矛盾。在美国儿科学会一项单中心研究关于早产儿高剂量iNO（＞20ppm）治疗使BPD的发生率略降低，但仍需进一步研究证明[14]，有研究表明iNO在BPD预防中没有效果[15]，总之不支持利用iNO吸入预防BPD[16]。血管生成中断是BPD的发病机制[17]。Yan等[18]研究发现TFG-β作为肺血管发育的调节因子，参与了BPD的形成。Goumans等[19]在体外实验中发现TGF-β抑制内皮细胞增殖、迁移，阻止血管形成，可能与TGF-β结合活化素受体样激酶5（ALK5）使Smad2/3磷酸化有关，而与上述信号通路功能相反的是TGF-β与活化素受体样激酶1（ALK1）使Smad1/5磷酸化[20]，仍需进一步实验验证其信号通路间的相关作用。
2.2 TGF-β1与肺的损伤、修复BPD病因复杂，遗传和环境因素协同作用于早产儿未成熟肺，炎症是导致BPD多因素起源的中心环节[21]。有研究表明新生儿呼吸窘迫综合征患儿因肺部发育不成熟，长时间暴露于高压和高氧等外界因素下导致支气管及肺泡受损，使得Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖、分化停滞，不能转化为Ⅰ型肺泡上皮，各种炎症因子及趋化因子导致肺部炎症、氧化应激和内皮损伤，阻止肺的发育，肺组织结构重建，组织纤维化，支气管和毛细气管及基底膜增厚，肺泡细胞凋亡、微血管受损，最终导致BPD形成[22]。肺部炎症可引起机械通气时间延长，进一步加重肺的损伤，形成恶性循环[23]。故目前认为肺发育不成熟、急性期损伤及损伤后异常修复是BPD发病的主要环节，而肺损伤和修复过程涉及EMC成分的变化和细胞生长、分化等。
2.2.1 TGF-β1与细胞外基质（ECM）人类妊娠后期是胎儿肺泡发育的关键时刻，在多种因素如早产、感染、高氧、机械通气的影响下会使肺泡化和微血管发育过程异常，可导致肺泡数量减少，肺泡壁增厚，最终形成BPD[24]。ECM是构成肺泡隔的主要成分，其含有具有连接及支持组织结构的弹性蛋白、胶原蛋白等物质，正常情况下，各部分合成及降解之间保持平衡。ECM蛋白沉积增加可干扰正常的器官功能及损害组织结构。BPD中肺泡发育异常以及肺泡隔增厚都与ECM异常有关。TGF-β1一方面是ECM沉积的有效驱动因素，与ECM具有强亲和力，在损伤部位形成促纤维因子池[25]。另一方面TGF-β1可以调节细胞对某些机制代谢酶，如机制金属蛋白酶（MMP）的分泌来影响ECM的组成[26]。TGF-β1过度表达可激活肺原位成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，引起胶原蛋白（I型、Ⅲ型）、纤连蛋白等细胞外基质相关蛋白过度积累，损伤肺泡结构导致肺纤维化[27，28]。胶原蛋白I主要定位于支气管、肺泡间隔和血管，在BPD患者中过度表达，导致BPD进展过程中肺泡间隔失效[29]。有研究表明，机械通气可诱导肺组织TGF-β1生成，启动有氧酵解，进一步促进肺纤维化[30]。TGF-β1与TGF-β1受体Ⅱ结合，引起磷酸化TGF-β1受体I激酶，进而激活Smad2/3通道，形成Smad2/3/4三聚体复合物进入细胞核，激活诱导细胞分化的转录因子P300及CPB。在高氧作用下，小鼠胶原蛋白与弹性蛋白比率较常氧组增加了3倍，与TGF-β信号刺激肺成纤维细胞有关[31]。具体的信号通路需进一步研究。朱富等[32]在体外试验中研究发现利用艾拉莫德一方面抑制TGF-β1诱导的胶原蛋白mRNA的合成及纤连蛋白的表达，另一方面可以通过抑制TGF-β1诱导的smad2/3通道而达到抑制细胞分化，抑制肺纤维化，故通过抑制TGF-β/Smad途径达到治疗BPD有望实现。
2.2.2 TGF-β1与上皮细胞的增殖、凋亡 反复的肺泡上皮细胞损伤是引起肺纤维化过程中异常修复的始动因素[33]。研究表明，BPD的病理变化与吸入氧浓度（60%）有关，主要表现为肺泡数量减少、间隔增厚及血管发育迟缓，而炎性渗出及肺纤维化较轻，但若吸入80%左右氧浓度时，其主要变化以炎症细胞浸润、渗出及肺纤维化为主[34]，引起这一病理变化的机制尚不明确。白琼等[35]发现利用活化素受体样激酶5抑制剂SB43154阻断TGF-β1/Smad途径，可使肺纤维化程度减轻，肺泡上皮细胞及支气管黏膜上皮细胞凋亡指数下降。说明肺纤维化过程中，有细胞凋亡的参与，而其可能的信号通路之一是TGF-β1/Smad。有报道TGF-β通过Smad3通路使得细胞内死亡相关蛋白激酶的表达上调，其与TGF-BRⅡ结合，激活了JNK/MAPK通路，诱导Fas受体相关蛋白TIEG和Daxx的表达，引起细胞凋亡[36]。有研究通过剔除小鼠细胞TGF-BRⅡ基因，减轻了肺泡上皮细胞的炎症和细胞的凋亡[37]，但仍需多中心大样本研究进一步证实。最近发现BPD小鼠的超氧化物歧化酶（SOD）活性随着丙二醛（MDA）水平的提高而降低，孟鲁司特作为一种有效的半胱氨酸白三烯（cysLT）受体拮抗剂可以降低炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1b表达及增强SOD活性，降低MDA表达，使得炎症反应及氧化应激对肺的损伤减轻[38]。通过增加SOD活性可以治疗BPD患者的肺损伤[39]。Kim等[40]经过多中心前瞻性随机研究发现孟鲁司特无预防BPD的作用，有待于进一步实验研究证明。TGF-β已证实在高氧引起的慢性肺疾病（CLD）新生大鼠肺组织中周期蛋白依赖性激酶-2（CDK-2）表达增加，而细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子（P27）降低，且随着用氧时间的延长，CDK-2的表达呈上升趋势，而P27的表达呈下降趋势[41]。说明细胞周期蛋白的异常表达引起了肺成纤维细胞的增殖。甚至有研究表明TGF-β1通过下调P27及上调CDK2促进细胞进入分裂周期，刺激肺成纤维细胞的增殖，引起BPD的形成[42]，故提示CKD2及P27可能为治疗BPD的靶点。TGF-β1诱导细胞产生活性氧（ROS），ROS是体内细胞在氧化系统中产生的一类衍生物，包括氧自由基、过氧化物及激发态氧。正常情况下ROS水平较低，低水平ROS对机体有保护作用，参与机体的修复、免疫及凋亡。ROS生成增多，可直接引起组织损伤，同时ROS作为TGF-β1的第二信使，进一步调节TGF-β1激活的信号转导途径如JIK、P38等[43，44]。硫氧环蛋白过氧化物酶-2（Peroxiredoxin-2，Prx-2）是一种新型过氧化物酶，通过降低ROS水平调控细胞内信号转导过程，从而影响细胞增殖、转移、蛋白合成及凋亡等生物学行为[44]。Prx-2过表达可能通过抑制ROS和JNK、P38通路激活，抑制TGF-β1促成纤维细胞增殖和胶原合成的作用，从而抑制纤维化[45]。
2.2.3 TGF-β1与上皮-间充质转化（EMT）上皮-间充质转化（EMT）在胚胎发育和组织重塑中发挥重要作用[46]。在正常肺情况下，肺泡Ⅱ型细胞可分化成肺泡Ⅰ型细胞，促进肺泡的形成。王思思等[47]通过新生大鼠持续吸入高浓度氧气制备的BPD模型中发现高氧可引起Ⅰ型肺泡上皮细胞（AEC1）上AQP5蛋白表达下降，且随着吸氧时间的延长AQP5持续下降，同时也可以导致Ⅱ型肺泡上皮细胞（AEC2）上SP-C蛋白表达下降，说明在高氧的刺激下，肺泡上皮细胞增殖及分化受到抑制，导致肺泡化功能障碍。杨海萍等[46]研究发现在BPD模型肺组织中，增殖的Ⅱ型肺泡细胞可能更多的发生了EMT，因为代表间充质细胞生物标记物N钙黏蛋白（N-cad）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）均增高，影响了AEC2向AEC1的分化，进而影响肺泡的发育，但其分子机制不明确。有研究表明TGF-β是EMT的中枢诱导剂，通过下调上皮标记物E-钙黏蛋白（E-cad）的表达和上调间充质标志物N-钙粘蛋白表达，而TNF样弱细胞凋亡诱导剂（TWEAK）与TGF-β起协同作用，发挥着修复重塑作用[48]。目前研究中发现在人肺上皮细胞中TGF-β诱导的EMT中需要转录因子YY1过表达，YY1的敲低消除了TGF-β的EMT和促纤维诱导，同时发现NF-κB信号转导可能在调节TGF-β/YY1过程中起着重要作用，但调控机制仍需进一步探索[49]。目前研究证明YY1是TGF-β诱导肺上皮细胞EMT和促纤维化的关键介质，为单独靶向抑制YY1或与TGF-β或NF-κB抑制剂联合治疗肺纤维化提供了依据。有学者在高氧诱导的大鼠BPD模型中发现应用孟鲁司特可使TGF-β1/Smads信号通路失活，下调TGF-β1的表达水平，抑制上皮-间充质转化，减轻肺纤维化，改善BPD[50]。TGF-β1可通过激活Smad2引起肺泡上皮细胞在体外和体内进行EMT[49]。最新研究表明通过沉默的长链非编码 RNA（lncRNA）X非活性特异性转录本（Xist）竞争性结合miR-1013p以抑制高迁移率族蛋白B3（HMGB3）并下调TGF-β1/Smad3轴，减轻BPD肺损伤[51]。有学者发现沉默的Xist抑制TGF-β调节的EMT和NSCLC细胞的生长[52]。这一发现为BPD的预防和治疗提供新线索。
结合目前研究可以发现，TGF-β1在早期促进远端肺发育过程中对肺泡化及肺血管形成至关重要，充分说明TGF-β1的正确数量和正确位置都是支持血管生长所必需的，但在肺损伤修复过程中过度的表达，导致肺纤维化，引起BPD的发生，进一步说明了TGF-β1在肺发育和损伤过程中的双重作用。虽然临床上有针对特发性肺间质纤维化的药物是通过抑制TGF-β而抑制ECM的沉积，抑制肌成纤维细胞生成达到治疗效果，但由于TGF-β1作用于机体的信号通路复杂，同时由于新生儿群体的特殊性，使得TGF-β1在BPD研究较局限，仍需进一步研究TGF-β1各信号通路之间复杂网络，选择针对性干预措施，其有望成为预防和治疗BPD的新靶点。
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