基于基质细胞衍生因子-1α/CXCR4通路研究氯吡格雷对大鼠颈动脉狭窄的改善作用

时间：2023-02-24 10:05:08 来源：千叶帆本文已影响人

刘婉丽，谭永辉，郑翼徳

（郴州市第一人民医院血管外科，湖南郴州 423000）

颈动脉是将血液由心脏输送至脑部的主要血管之一，颈动脉狭窄是指颈动脉内径变小甚至闭塞［1］，其发病机制复杂，炎症反应、自身免疫、动脉粥样硬化等均与颈动脉狭窄发病相关，常伴有头晕、记忆力下降、肢体麻木、意识障碍等不良表现，长期狭窄可引起慢性脑缺血缺氧，导致神经功能受损，严重的颈动脉狭窄可引起脑梗死甚至死亡，严重危害患者生命健康［2-3］。氯吡格雷是抑制血小板聚集的药物，常用于预防、治疗由于血小板高聚集引起的脑卒中、心肌梗死、动脉循环障碍等疾病，在颈动脉内膜切除术中的使用几率较大［4-5］，Graham 等［6］研究发现，在现有的抗血栓治疗中加入氯吡格雷可显著减少颈动脉狭窄引起的微栓塞数量。龚煜等［7］研究发现，阿司匹林联合氯吡格雷可显著降低颈动脉狭窄患者的颈动脉内膜中层厚度，且临床效果较好，但关于其作用机制研究较少。基质细胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）及其特异性受体CXCR4 与胚胎发育、血管新生、炎症反应等生理病理过程密切相关，具有促进细胞迁移黏附、血管生成、内膜增生等作用［8-9］。秦合伟等［9］研究发现，动脉粥样硬化小鼠主动脉组织中SDF-1α、CXCR4 浓度显著较高，并认为SDF-1α/CXCR4 生物轴可能是冠心康干预动脉粥样硬化形成的作用靶点之一。因此，本研究在前人的研究基础上探究氯吡格雷对颈动脉狭窄及SDF-1α/CXCR4 通路的影响。

1.1 动物

40 只无特定病原体（SPF）级SD 雄性大鼠购于南方医科大学，生产许可证号为SCXK（粤）2016-0041。所有大鼠均于本院动物房中饲养并适应性喂养1 周，采取自然光照及通风，自由饮食、饮水，动物房内温度保持在25℃左右，相对湿度保持在50%左右，按时对动物房及鼠笼进行清洁。

1.2 主要试剂及仪器

氯吡格雷（75 mg/片，国药准字：J20080090）购于杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司；
单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、C 反应蛋白（C reactive protein，CRP）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、改良苏木素-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色试剂盒、全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：SERK-0024、SERK-0017、SERK-0053、SERK-0012、G1121、BC3710、PC0020）购于北京索莱宝科技有限公司；
SDF-1α ELISA 试剂盒（货号：ml026159）购自上海酶联生物科技有限公司；
α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、SDF-1α、CXCR4、GAPDH 兔源抗体、羊抗兔IgG 抗体（货号：EPR5368、ab18919、ab124824、ab9485、ab150077）购于英国Abcam。

Bio-rad680 酶标仪购于美国伯乐；
TS3B 全自动生物组织脱水机购于浙江金华市科迪仪器设备有限公司；
MA752 组织切片机购于英国Campden；
DMD108 光学显微镜购于德国徕卡；
BOND-Max 全自动免疫组化和原位杂交多功能染色机购于德国leica；
JY300 蛋白电泳仪购于北京君意华鑫科技有限公司；
TE70X 半干转膜仪购于美国Hoefer；
Quan⁃tum CX5 凝胶成像仪购于法国Vilber。

1.3 动物模型制备及分组给药

颈动脉狭窄大鼠模型的构建参考文献［10］的方法并稍作修改，40 只SD 大鼠按照随机数字法分为假手术组（8 只）、造模组（32 只）。将大鼠麻醉后保持仰卧位固定，消毒大鼠颈部皮肤后沿颈部正中线做长度约为4 cm 的切口，逐层分离肌肉后使颈动脉暴露，在颈总动脉近心端与颈外、颈内动脉交叉处的1.5 cm 处做约为血管横截面1/3 的切口，将10 mL 注射器的针头插入上述切口，保持针头与血管平行，用0 号手术线结扎颈动脉及针头，小心拔出针头，缝合伤口并做消毒处理。假手术组仅暴露颈动脉，不做结扎处理。两组随机选取两只大鼠，解剖后获取狭窄动脉组织，清洗后进行HE 染色，观察到造模组大鼠颈动脉新生内膜明显增厚即可说明颈动脉狭窄模型构建成功。造模过程中，大鼠出现死亡现象，及时选取备用大鼠进行补充。

将造模成功的大鼠按照随机数字法分为模型组、氯吡格雷低剂量组（3 mg/kg）、氯吡格雷中剂量组（6 mg/kg）、氯吡格雷高剂量组（12 mg/kg）［11］，每组8 只。术后3 d 按照各组给药剂量进行灌胃处理，连续灌胃1 周。

1.4 大鼠血液及颈动脉组织采集

末次给药结束后24 h，将各组大鼠麻醉后行心脏取血（约4 mL），离心后收集血清用于炎症因子浓度的测定；
取血结束后将各组大鼠处死，采集结扎处颈动脉组织，用于颈动脉病理学观察及相关蛋白表达水平的检测。

1.5 大鼠血清炎症因子浓度检测方法

取1.4 中各组大鼠血清，用CRP、MCP-1、TGFβ、PGE2、SDF-1α 相关ELISA 试剂盒检测血清中炎症因子浓度，具体操作方法参考相关试剂盒中的说明书。

1.6 大鼠颈动脉组织病理损伤观察

取出1.4 中各组大鼠适量颈动脉组织，清洗干净后固定于4%多聚甲醛中（24 h），用水将颈动脉组织上的甲醛溶液冲掉，对颈动脉组织进行脱水、透明处理，接着将融化的石蜡完全浸入颈动脉组织中，待其凝固后进行修剪并切片，将得到的石蜡切片经过二甲苯Ⅰ脱蜡10 min、二甲苯Ⅱ脱蜡10 min、无水乙醇Ⅰ2 min、无水乙醇Ⅱ2 min、95%乙醇2 min、80%乙醇2 min、70%乙醇2 min、蒸馏水2 min、苏木素染色5 min、分化液分化5 s、返蓝液返蓝1 min、伊红染色2 min、80%乙醇3 s、90%乙醇3 s、95%乙醇3 s、95%乙醇3 s、无水乙醇1 min、二甲苯Ⅰ1 min、二甲苯Ⅱ1 min、封片等步骤得到病理组织切片，具体操作参考HE 染色试剂盒的要求，于光学显微镜下观察后拍照并进行观察。

1.7 免疫组化检测大鼠颈动脉组织中α-SMA浓度

将包有大鼠颈动脉组织的石蜡切片进行常规脱蜡复水，置于3%H2O2中孵育30 min，经过碱修复、加热、煮沸后于5%牛血清白蛋白中37℃孵育1 h，加入兔源α-SMA 一抗（稀释比为1∶800），4 ℃冰箱中孵育过夜后加入羊抗兔二抗（1∶1 000），二氨基联苯胺（DAB）显色后经苏木精复染核、中性树胶封片，置于光学显微镜中观察并拍照，采用Image J 软件对染色结果进行半定量分析。

1.8 大鼠颈动脉组织SDF-1α/CXCR4 通路蛋白以及α-SMA 蛋白表达检测

取1.4 中各组大鼠适量颈动脉组织，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗干净后剪碎，加入组织裂解液低温研磨，根据蛋白质提取试剂盒的要求提取其中蛋白质，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其中蛋白质浓度。将各组大鼠颈动脉组织蛋白质溶液调至浓度相同，取5 μL待测液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，接着采用湿转法将蛋白转移至硝酸纤维膜，将上述纤维膜用5%脱脂奶粉进行封闭处理2 h，用TBST 冲洗掉纤维膜上的封闭液后加入α-SMA、SDF-1α、CXCR4、GAPDH 兔源一抗（稀释比为1∶1 000），4 ℃冰箱中孵育过夜后取出，用TBST 冲洗后加入辣根过氧化物标记的羊抗兔二抗，孵育1 h经过显色处理后进行定影观察并拍照分析。

1.9 统计学分析

用SPSS 22.0 数据处理软件对实验所得数据进行统计分析。计量资料以（）表示，单因素方差分析组间差异，进一步两组间比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 颈动脉狭窄大鼠模型构建成功验证

假手术组大鼠颈动脉组织正常；
与假手术组相比，造模组大鼠颈动脉新生内膜显著增厚，颈动脉腔管面积较小，结扎损伤法构建大鼠颈动脉狭窄模型构建成功。见图1。

图1 假手术组与造模组大鼠颈动脉脉组织光学显微镜下图像（HE 染色；
A 为假手术组；
B 为造模组）

2.2 各组大鼠血清炎症因子浓度比较

与假手术组大鼠相比，模型组大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2、SDF-1α浓度显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与模型组组大鼠相比，氯吡格雷各剂量组大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2、SDF-1α 浓度显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈现一定的剂量依赖效应，见表1。

表1 各组大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2、SDF-1α 浓度比较［n=8，］

注：与假手术组比较，aP＜0.05；
与模型组比较，bP＜0.05；
与氯吡格雷低剂量组比较，cP＜0.05；
与氯吡格雷中剂量组比较，dP＜0.05

2.3 各组大鼠动脉组织结构比较

假手术组大鼠颈动脉组织结构完整，内膜无明显病变，中膜平滑肌细胞、弹力纤维层结构清晰；
与假手术组大鼠相比，模型组大鼠颈动脉组织管腔狭窄严重，内膜增厚明显，中膜弹力纤维层混乱；
与模型组大鼠相比，氯吡格雷各剂量组大鼠颈动脉组织内膜增厚现象得到缓解，且呈现一定的剂量依赖效应，其中高剂量组效果较好，见图2。

图2 各组大鼠颈动脉组织显微镜下图像（HE 染色；
×200；
A 为假手术组；
B 为造模组；
C 为氯吡格雷低剂量组；
D 为氯吡格雷中剂量组；
E 为氯吡格雷高剂量组）

2.4 各组大鼠颈动脉组织α-SMA 浓度比较

与假手术组大鼠相比，模型组大鼠颈动脉组织α-SMA表达显著增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与模型组相比，氯吡格雷各剂量组大鼠颈动脉组织α-SMA 表达显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈现一定的剂量依赖效应，见图3、图4。

图3 各组大鼠颈动脉组织α-SMA 浓度免疫组化检测结果比较（免疫组化染色；
×200；
A 为假手术组；
B 为造模组；
C 为氯吡格雷低剂量组；
D 为氯吡格雷中剂量组；
E 为氯吡格雷高剂量组）

图4 各组大鼠颈动脉组织中α-SMA相对浓度比较柱状图

注：与假手术组比较，aP＜0.05；
与模型组比较，bP＜0.05；
与氯吡格雷低剂量组比较，cP＜0.05；
与氯吡格雷中剂量组比较，dP＜0.05

2.5 各组大鼠颈动脉组织SDF-1α/CXCR4 通路蛋白以及α-SMA 蛋白表达比较

与假手术组大鼠相比，模型组大鼠颈动脉组织SDF-1α、CXCR4、α-SMA 蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与模型组大鼠相比，氯吡格雷低、中、高剂量组大鼠颈动脉组织SDF-1α、CXCR4、α-SMA 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈现一定的剂量依赖效应，见图5、表2。

表2 各组大鼠颈动脉组织SDF-1α、CXCR4、α-SMA蛋白相对表达量比较［n=8，］

注：与假手术组比较，aP＜0.05；
与模型组比较，bP＜0.05；
与氯吡格雷低剂量组比较，cP＜0.05；
与氯吡格雷中剂量组比较，dP＜0.05

图5 各组大鼠颈动脉组织SDF-1α、CXCR4、α-SMA 蛋白相对表达量比较（A 为假手术组；
B 为造模组；
C 为氯吡格雷低剂量组；
D 为氯吡格雷中剂量组；
E 为氯吡格雷高剂量组）

颈动脉狭窄主要是动脉血管中出现粥样斑块，斑块不稳定、机体炎症反应等均为颈动脉狭窄发生的不良因素，严重时会引起血管闭塞，造成脑部缺血、缺血性脑卒中、血管性认知障碍等不良疾病的发生，严重危害患者的生命健康［12-13］。建立一种重复性好、狭窄程度易控制、操作简单的动物模型对于研究颈动脉狭窄具有重要意义，张羽乔等［14］采用“针控线栓法”构建大鼠颈动脉狭窄模型，构建的动物模型成功率较高且较稳定。本研究采用此方法构建颈动脉狭窄动物模型，结果显示，造模组大鼠新生内膜显著增厚，颈动脉腔管面积显著减小，血清炎症因子（CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2）浓度显著升高，与王鸿康等［15］研究结果一致，表明大鼠颈动脉狭窄模型构建成功。颈动脉狭窄可造成血管内炎症反应加剧，而大量炎症细胞浸润及炎症因子的过度释放对于血管损伤后的内膜增生具有不利影响［15］。

针对颈动脉狭窄患者，应当采用血管内介入治疗，但由于血管内治疗技术水平有限、术后并发症较多、治疗费用偏高等因素不易被患者接受，因此抗血小板聚集类药物仍是临床中常用的治疗药物。氯吡格雷是第二代口服噻吩吡啶，具有抑制血小板聚集、抗炎等多种生物学作用［16-17］。研究发现氯吡格雷还具有抗神经元凋亡、缓解缺血性脑卒中等作用［18］，对颈动脉内膜切除术后复发及临床缺血事件的发生率具有一定的降低作用［19］。氯吡格雷联合阿司匹林可显著抑制颈动脉狭窄患者血小板活化、抑制炎症因子释放、增强斑块稳定性等，并显著改善患者的预后情况［20］。α-SMA可与血管内平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）特异性结合，测定血管组织中α-SMA 表达可反映VSMCs 的分布及浓度，当血管受到损伤时可引起VSMCs 的恶性增殖，进而造成血管腔狭窄［21］。本研究结果显示，与模型组大鼠相比，氯吡格雷各剂量组大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2浓度显著降低，颈动脉组织内膜增厚现象得到缓解，颈动脉组织α-SMA 表达降低，提示氯吡格雷可显著抑制颈动脉狭窄、大鼠机体炎症反应及VSMCs 的恶性增殖，对于颈动脉狭窄大鼠具有一定的缓解作用，但其作用机制仍不清晰。

SDF-1 主要有SDF-1α、SDF-1β 两种形式，主要以SDF-1α 为主，SDF-1α 属于CXC 类趋化因子，在心脏、肝脏、小肠等组织中均有表达。CXCR4为CXC 类趋化因子受体，是SDF-1α 的特异性受体，SDF-1α/CXCR4 轴与细胞运动、细胞黏附、血管生成、血管生长等生物学行为密切相关［22-23］。资料显示，当机体组织受到损伤时，SDF-1α 的表达增加，进而激活CXCR4，使得炎症细胞因子向受损部位聚集，同时促进炎症因子对受损组织的浸润，进而导致血管内皮功能障碍及VSMCs 增殖异常［24］。研究发现SDF-1α、CXCR4 在颈动脉粥样硬化大鼠血清中呈现高表达，与动脉粥样硬化的发生密切相关［25］。临床研究发现，氯吡格雷联合银杏二萜内酯葡胺对治疗急性脑梗死疗效显著，能有效抑制炎症反应，延缓动脉粥样硬化发展［26］。本研究结果显示，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠机体炎症反应升高的同时，血清SDF-1α浓度、颈动脉组织中SDF-1α、CXCR4 蛋白表达水平也显著升高，提示SDF-1α/CXCR4 轴可能参与了颈动脉新生内膜的增厚过程，与颈动脉狭窄密切相关；
与模型组大鼠相比，氯吡格雷各剂量组大鼠血清SDF-1α 浓度、颈动脉组织中SDF-1α、CXCR4蛋白表达水平显著降低，表明氯吡格雷减轻炎症反应，缓解颈动脉内膜组织增厚，与其降低SDF-1α、CXCR4 蛋白表达水平的作用机制有关，提示氯吡格雷可能通过抑制SDF-1α/CXCR4 通路，抑制炎症反应，发挥缓解颈动脉狭窄作用。

综上所述，氯吡格雷可显著缓解颈动脉狭窄大鼠的炎症反应及颈动脉内膜增厚现象，可能是通过抑制SDF-1α/CXCR4 通路实现的，但氯吡格雷作用机制及颈动脉狭窄发病机制复杂，氯吡格雷是否通过其他途径发挥作用仍不清晰，因此仍需深入研究。

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