植物NLR免疫受体蛋白的结构生物学研究进展

李佳,陶小荣

(南京农业大学植物保护学院植物病理学系/教育部农作物生物灾害综合治理重点实验室/作物免疫学重点实验室,江苏 南京 210095)

真菌、病毒、细菌等病原生物采取多种策略侵染植物影响植物生长发育,植物则逐渐进化出一套复杂的免疫系统来抵御病原生物的侵染。NLR(nucleotide binding leucine-rich repeat)蛋白是植物免疫系统中的一个免疫受体大家族,能够准确识别病原生物分泌到细胞内的效应蛋白,激活由效应蛋白触发的免疫反应(effector-triggered immunity,ETI)。植物ETI的激活通常伴随着过敏性反应(hypersensitive response,HR),通过诱导侵染位点的细胞死亡来限制病原生物增殖,同时引起植物激素水杨酸(salicylic acid,SA)的积累,进一步诱导邻近细胞产生系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)[1-2]。

植物进化产生了数量庞大的NLR免疫受体用于监测病原生物的侵染,但是NLR蛋白的数量在不同植物中存在较大差异。基于生物信息学分析,发现苹果、水稻、拟南芥中分别含有737、 438、151个 NLR蛋白,陆地植物苔藓中含有49个,藻类植物中只在少数类群中出现,大部分则没有NLR[5,8]。1994年,科学家第1次克隆到植物NLR免疫受体基因,分别是烟草(Nicotianatabacum)的N基因和拟南芥(Arabidopsisthaliana)的RPS2基因[9-11]。20多年来,科学家们付出了巨大的努力,迄今已经成功克隆了200个左右的NLR抗病基因,并且被广泛地应用于作物抗病育种[12]。近年来,随着蛋白质晶体学和低温冷冻电镜技术的高速发展,植物NLR蛋白的结构生物学研究取得了一系列重要进展[13-14],尤其是2019年第1个植物完整NLR 受体——ZAR1激活前后结构的解析,首次发现了植物“抗病小体”的存在,为NLR免疫受体激活植物免疫的作用机制研究提供了全新的思路[15-19]。

1.1 N端结构域

2011年,Bernoux等[20]解析第1个植物NLR蛋白L6的TIR结构域晶体结构。表1列举了目前为止已报道三维结构的所有TIR结构域,包括拟南芥RPS4 TIR、RRSI TIR、SNC1 TIR、RPP1 TIR,圆叶葡萄RPV1 TIR、RUN1 TIR以及本氏烟草ROQ1 TIR[21-27]。除了RPP1和ROQ1的TIR是在免疫受体完整蛋白激活状态下的构象外,其余免疫受体的TIR均是单独表达TIR结构域获取的晶体结构。如图1-A所示,所有的TIR都呈现出相似的结构特征,即5 个α螺旋三维环绕4～5个平行β折叠片构象。TIR结构域具有自我聚集形成二聚体或者多聚体的能力,RPS4和RRS1的TIR结构域还能够形成异源二聚体,破坏TIR结构域的寡聚会中断全长免疫受体蛋白激活后的下游信号转导[20-21,23-24]。此外,TIR结构域还具有NAD+切割活性,这一活性对于免疫受体蛋白激活后诱导的细胞死亡是必需的。研究发现,TIR结构域自我寡聚缺陷的突变体丧失了NAD酶活性以及诱导细胞死亡的能力,但是TIR结构域NAD酶活性中心突变体却不影响其自身寡聚[25,28]。TIR的自我寡聚化会促进TIR的NAD酶活性,进一步促进下游免疫信号的转导[26]。RPS4的TIR结构域能够直接诱导细胞死亡,而 RRS1的TIR单独不能直接引发细胞死亡,反而抑制RPS4 TIR结构域诱导的细胞死亡。RRS1 TIR结构域在诱导细胞死亡方面的功能差异可能与其三维结构的独特性有关,RRS1 TIR在4号螺旋区域(橙色区域)的短螺旋仅有1个(其他TIR有3个),且该螺旋方向与其他TIR的4号螺旋区域几乎垂直。在RPP1抗病小体结构中,4号螺旋区域在NAD酶活性中心的形成中发挥重要作用,因此,RRS1 TIR自身虽然能够形成同源二聚体,可能无法形成有效的NAD酶活性中心,所以不能直接引发细胞死亡。

表1 文章涉及的植物免疫受体结构Table 1 Structures of plant immune receptors covered in this review

与TIR结构域类似,植物NLR蛋白N端CC结构域也具有较为保守的三维结构特征,除大麦MLA10 CC是由2个螺旋-环-螺旋结构组成的二体以外,Rx、Sr33以及失活态/中间态ZAR1的CC结构域均为具4螺旋束卷曲结构的单体形式[15-16,29-31](图1-B)。Casey等[30]利用体积排阻色谱耦合多角度光散射技术发现MLA10 CC在溶液中表现出单体的性质,并认为MLA10 CC特殊的二体形式可能是由于其特殊的结晶条件(高盐和低pH值)导致的。NRG1.1是在TNL下游发挥作用的辅助NLR,其N端CC结构域与RPW8类似,因此其CC结构域也被归为CCR。如图1-B所示,NRG1.1 CC也呈现出与其他类型CC相似的三维结构特征。最新的研究表明,NRG1.1 CC的三维构象与真菌膜穿孔HeLo/HELL结构域和哺乳动物混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed-linage kinase domain-like,MLKL)N端的4螺旋束结构域类似,且具有相对保守的功能位点[41-42]。与拟南芥失活态ZAR1的CC结构域相比,激活态ZAR1 CC结构域的构象发生了明显变化,其N末端第1个螺旋α1单独暴露出来[15-16](图1-B)。单独的CC结构域也具有诱导细胞死亡的能力,但是目前的研究表明,CC结构域能否表现出诱导细胞死亡的特性似乎跟CC片段的截取长度有关,通过Pfam分析预测Sr33的CC结构域为6～134位氨基酸,但功能试验却显示1～142位氨基酸是Sr33 CC诱导细胞死亡表型所必需的[43-44]。图1-B中解析的Sr33 CC结构域覆盖了6～120位氨基酸,结合CC的功能研究和ZAR1 CC激活态的三维结构构象,推测目前解析的Sr33、Rx以及NRG1.1 CC的三维结构可能都处于失活状态时的构象。

图1 植物NLR免疫受体TIR(A)和CC(B)结构域的三维结构特征Fig.1 Structural features of TIR(A)and CC(B)domain of plant NLR immune receptor

1.2 NB-ARC结构域

NB-ARC结构域属于信号传导腺苷三磷酸ATP酶(signal transduction ATPases with numerous domains,STAND)超家族成员,具有结合和水解核苷酸的功能,通常被认为具有“分子开关”的作用[45]。NLR免疫受体的激活与否往往伴随着NB-ARC结构域结合ADP或者ATP状态的切换[46-50]。目前,关于NB-ARC结构域三维结构的报道并不多,单独表达NB-ARC结构域并获得结构信息的只有NRC1的NB-ARC结构域[40],在最近报道的多个植物抗病小体中揭示了更多关于NB-ARC结构域的三维结构信息[15-16,26-27]。NRC1是一个在番茄抗病蛋白Cf-4下游发挥作用的辅助CNL,NRC1 NB-ARC与失活态ZAR1 NB-ARC的三维结构特征相似,ADP结合在由NB、ARC1和ARC2共同形成的空腔位置(图2),推测NRC1 NB-ARC结构域可能处于失活态的构象。与失活态ZAR1 NB-ARC相比,中间态ZAR1 NB-ARC的空间构象发生了明显变化,NB结构域向外旋转约60°,这种开放的空间构象可能有利于ADP的释放以及ATP的进入(图2)。在激活态ZAR1 NB-ARC中,ARC2结构域较失活态和中间态时有较大的旋转幅度,此时处于结合ATP的状态。激活态RPP1和ROQ1 NB-ARC的三维结构特征均与激活态ZAR1相似,唯一不同的是RPP1激活态时的NB-ARC结合的是ADP,而不是ATP。

图2 植物NLR免疫受体NB-ARC结构域的三维结构特征Fig.2 Structural features of NB-ARC domain of plant NLR immune receptor

1.3 非典型结构域

除了具有非常保守的典型结构域,有些NLR免疫受体蛋白上还包含额外的非典型结构域。这些非典型结构域整合在受体蛋白N末端、C末端或者嵌入到典型结构域之间的位置,在植物免疫过程发挥重要作用[51]。多项研究表明,非典型结构域主要功能之一是参与免疫受体对病原生物效应蛋白的识别过程[52-53]。目前有三维结构信息报道的非典型结构域有重金属结合结构域[32-35,38-39,54](heavy metal-associated domain,HMA)、WRKY结构域(WRKY protein domain)[36-37],以及茄科抗病基因特有SD(Solanaceaedomain)结构域[55],其中以HMA结构域的结构生物学研究最为深入。HMA结构域又被称作RATX1结构域(related to yeast copper transporter ATX1,RATX1),水稻NLR免疫受体RGA5、Pik系列等位基因中均含有HMA结构域。RGA5中的HMA融合在其C末端[56],Pik中的HMA则嵌合在其CC和NB-ARC典型结构域之间[32]。目前认为HMA结构域作为一个整合型诱饵蛋白发挥监测识别稻瘟病菌效应蛋白的作用,可能是由于水稻中存在一个含有HMA结构域的隐性抗病基因Pi21,Pi21功能缺陷的水稻更有利于稻瘟病菌的侵染[5,12]。RGA5能够识别稻瘟病菌效应蛋白AVR-Pia和AVR1-CO39,激活RGA4介导的免疫反应;Pik能够识别稻瘟病菌效应蛋白AVR-PikA、AVR-PikD以及AVR-PikE,目前还没有Pik类免疫受体能够识别AVR-PikC[35]。

Pik多个HMA结构域及其与稻瘟病菌效应蛋白复合物的晶体结构展示了各自的结构特征以及互作界面,所有HMA结构域的三维结构表征为由4股反平行β片和2股α螺旋组成的α/β三明治,AVR-Pik、AVR-Pia以及AVR1-CO39等效应蛋白都包含一个由6股β片构成的三明治保守结构,破坏HMA和效应蛋白的互作均会干扰全长免疫受体蛋白对病原生物正常的识别过程,阻断免疫反应的激活。HMA跟不同效应蛋白的互作界面存在差异,如AVR1-CO39和AVR-PikD与HMA互作的界面处于HMA上2个完全相反的侧面[38]。最近的研究发现,Pikp在一定程度上也能识别“错配的”AVR-Pia(AVR-Pia原本被RGA5识别),并在本氏烟草上诱导微弱的细胞坏死反应。对比Pikp HMA/AVR-PikD和Pikp HMA/AVR-Pia复合物的晶体结构,发现AVR-PikD和AVR-Pia也结合在HMA不同的空间位置[35]。这些关于HMA结构域及其与效应蛋白复合物的结构生物学研究,揭示了结构相似的HMA结构域如何特异性识别序列差异明显但结构相似的稻瘟病菌效应蛋白的结构基础。此外,多项结构数据表明,在缺乏病原生物效应蛋白的情况下,HMA结构域以二体形式存在[32,38]。有些效应蛋白如AVR1-CO39存在时,HMA无法形成二体[38]。分析结构发现,AVR1-CO39与HMA的互作界面和HMA二体形成界面存在明显重叠,这一竞争关系可能是干扰HMA二体形成的原因。但是这一现象的生物学意义尚不清楚,仍需进一步研究。

2.1 ZAR1抗病小体

NLR免疫受体完整蛋白的三维结构解析一直是免疫学领域的重点和难点课题。2013年,清华大学柴继杰教授研究团队报道了第一个近乎全长的小鼠NLR免疫受体蛋白——NLRC4自抑制状态的晶体结构,揭示了NLRC4蛋白通过各个结构域分子间相互作用维持自抑制状态的分子机制[57]。随后,柴继杰教授课题组和隋森芳院士课题组进一步合作解析了NAIP-NLRC4复合物炎症小体的冷冻电镜结构,揭示了NLR免疫受体NAIP识别病原生物效应蛋白后如何激活处于自抑制状态的NLRC4,以及NLRC4进一步发生自身多聚化形成包含1个NAIP和10个NLRC4盘状结构的过程[58]。植物NLR免疫受体激活是否也形成类似动物NLR炎症小体的结构?2019年,清华大学柴继杰教授课题组、王宏伟教授课题组联合中科院遗传与发育生物学研究所周俭民研究员课题组,率先解析了第一个植物完整NLR免疫受体ZAR1激活前、后的结构,填补了植物NLR免疫受体全长蛋白结构的空白[15-16,59-60]。

如图3所示,ZAR1与受体样胞质激酶(receptor-like cytoplasmic kinase,RLCK)家族成员RKS1形成复合物,并结合ADP,以单体的形式处于失活态;当病原细菌效应蛋白对PBL2激酶进行尿苷酸修饰形成PBL2UMP后,PBL2UMP上的UMP基团会与ZAR1-RKS1复合体中的RKS1发生相互作用,并导致ZAR1 的NB结构域向外发生约60°的旋转。ZAR1-RKS1-PBL2UMP中间态有利于ADP的释放以及后续dATP/ATP的结合;当ZAR1-RKS1-PBL2UMP复合物中加入dATP/ATP后,ZAR1-RKS1-PBL2UMP复合物发生显著的构象变化,由中间态转换为激活态:CC结构域第1个螺旋α1单独暴露出来,NB、ARC1、ARC2以及LRR结构域都向有利于发生寡聚化的构象发生变化。完全激活的ZAR1通过各个结构域之间的相互作用,最终形成轮状结构的ZAR1五聚体,并结合dATP/ATP。RKS1和PBL2UMP并不直接参与ZAR1五聚体的形成。激活态ZAR1五聚轮状结构虽然与NLRC4炎症小体有较大差异,但是仍具有激活后形成寡聚化复合体的共同特征,被命名为“抗病小体(resistosome)”。5个ZAR1单体CC结构域的第1个螺旋α1组成了一个突出的漏斗状结构。生化与功能试验数据表明,这一结构与抗病小体是否定位于质膜以及是否诱导细胞死亡密切相关,暗示ZAR1抗病小体可能在质膜上穿孔并形成离子通道。2021年,周俭民研究员及其合作者发现ZAR1抗病小体在体外试验中能够直接插入脂膜,发挥Ca2+离子通道作用,并通过单分子成像技术证实ZAR1在质膜上组装成五聚体复合物[61]。Jacob等[41]也发现另一类位于TNL免疫受体下游的植物免疫受体——辅助NLR蛋白NRG1和ADR1,可以作为一个钙离子通透性的阳离子通道发挥作用。

图3 植物ZAR1抗病小体的形成Fig.3 The formation of ZAR1 resistosome

2.2 RPP1 和ROQ1抗病小体

作为植物NLR免疫受体蛋白的另一大类型,TNL免疫受体N端TIR结构域具有NAD+水解酶活性(NADase),TNL全长蛋白激活后是否也形成类似CNL的抗病小体成为亟待回答的问题。2020年12月,Science杂志同期发表了2篇报道植物TNL识别病原生物效应蛋白后形成抗病小体的研究论文:柴继杰教授团队成功解析了RPP1结合卵菌效应蛋白ATR1后形成四聚体激活状态的三维冷冻电镜结构(图4-A),并与德国马克斯-普朗克植物育种研究所的2位合作者一起利用生物化学和遗传学手段,揭示了RPP1抗病小体具有NAD酶全酶活性及其进一步激活下游免疫信号的分子机制[26];美国加州大学伯克利分校Brian J. Staskawicz教授和Eva Nogales教授团队则解析了另外一种TNL类免疫受体ROQ1识别黄单胞细菌效应蛋白XopQ后形成四聚化抗病小体的冷冻电镜结构[27](图4-B)。RPP1和ROQ1 LRR结构域的C端都包含一个新的额外结构域,这一结构与专门结合抗原的免疫球蛋白结构类似,故被命名为C-JID结构域(C-terminal jell roll and Ig-like domain)。序列分析发现,几乎所有TNL免疫受体蛋白C末端都含有C-JID结构域,暗示其可能是一个具有广谱功能的保守结构域。C-JID与LRR结构域共同介导了对病原生物效应蛋白的直接互作过程(图4)。与ZAR1抗病小体由CC结构域形成一层突出的漏斗状结构(图3)不同,2个TNL抗病小体形成了3层环状结构,分别是由TIR结构域组成的顶部环形结构,由 NB-ARC结构域组成的中间环形结构,以及由LRR-C-JID及病原生物效应蛋白组成的底部环形结构。

图4 植物RPP1(A)和ROQ1(B)抗病小体的结构特征Fig.4 Structural characteristics of RPP1(A)and ROQ1(B)resistosome

在RPP1抗病小体中(图4-A),2个TIR结构域通过头尾互作形成二聚体,2个TIR二聚体进一步通过C2对称形成四聚体。2个ATP分子结合在2个TIR二聚体的头尾互作界面,该结合位置与TIR NAD酶水解底物NADP+的结合位点重叠。TIR二聚体的形成稳定了两者头尾互作界面处其中一个TIR的BB环构象,该环上的一些关键氨基酸对于维持RPP1 的NAD酶活性非常重要。此外,单独的RPP1蛋白几乎没有NAD酶活性,只有RPP1和ATR1形成的四聚抗病小体才表现出依赖于金属离子的NAD酶活性[26]。这些发现表明,RPP1识别ATR1激活后形成了四聚化的抗病小体,其中2个头对尾的二聚体TIR形成了完整的NAD酶活性中心,促使RPP1抗病小体作为一个NAD酶全酶催化NAD+水解。ROQ1具有与RPP1抗病小体类似的结构特征(图4-B),较为明显的区别在于两者NB-ARC结构域结合ADP/ATP的状态:ROQ1激活态结合着ATP,而RPP1激活态结合着ADP。分析蛋白序列与结构发现,ROQ1和ZAR1都具有结合ATP分子的保守“TTR”基序,而RPP1上该基序突变为“TTE”,导致其丧失结合ATP的活性。目前学术界普遍认为NLR激活态时结合ATP分子,尚不清楚这一特殊现象的生物学意义。

相对于病原生物的庞大数目,植物中NLR蛋白的数量非常有限[12]。近年来,科学家们开始尝试对NLR免疫受体进行人工设计以扩大或改良其识别病原物特异性,并取得了显著成效。主要策略是通过在免疫受体上随机引入氨基酸突变位点,进而直接对免疫受体进行分子设计以增强或者扩宽其识别病原生物的特异性。运用这一策略已获得较多成功的示例,如在马铃薯免疫受体Rx的LRR功能域进行突变不仅可以增强其识别病原物特异性,同时在其NB功能域进行突变可以增强其激活敏感性[62-63];番茄免疫受体蛋白Sw-5b经过人工随机突变筛选,获得了对番茄斑萎病毒野生型及其田间抗性突破变异株系的抗病性[64]。由于随机突变产生的突变体数量庞大,前期筛选以及功能鉴定任务较为繁重。植物NLR免疫受体识别病原生物效应蛋白分子的新理论机制,为优质抗病资源的分子设计和改造提供了新的思路和方向。目前一种新的有益尝试是对植物体内的诱饵蛋白进行人工改造,使NLR能够识别其他病原生物的效应蛋白,丁香假单胞菌效应蛋白AvrPphB具有蛋白酶活性,能够切割拟南芥中被免疫受体RPS5监测的诱饵蛋白PBS1,RPS5一旦感知到PBS1被切割,就会启动植物的先天免疫系统来抵抗病原物侵染。研究人员将PBS1蛋白的切割位点替换成能够被芜菁花叶病毒NIa蛋白酶切割的识别位点,成功赋予了RPS5对植物病毒的新抗性[65]。

植物NLR免疫受体与病原生物效应蛋白复合物高分辨率三维结构的解析为科研人员开展NLR的精准设计和改造提供了可能。水稻Pikm能够识别稻瘟病菌效应蛋白AVR-PikA、AVR-PikD和AVR-PikE,但是Pikp只能识别AVR-PikD,而不能识别AVR-PikA和AVR-PikE。英国结构生物学家Mark J. Banfield教授的研究小组解析了多个Pik HMA结构域与AVR-Pik的复合物晶体结构,包括Pikp HMA&AVR-PikD、Pikp HMA&AVR-PikE、Pikm HMA&AVR-PikA、Pikm HMA&AVR-PikD、Pikm HMA&AVR-PikE[32-35]。系统比较分析这些复合物结构中HMA和效应蛋白互作界面的关键氨基酸残基,研究人员将Pikp HMA第261位天门冬酰胺(N)和第262位赖氨酸(K)分别突变成赖氨酸(K)和谷氨酸(E),产生了PikpNK-KE突变体。PikpNK-KE不仅保留了对AVR-PikD的识别能力,同时也能识别AVR-PikA和AVR-PikE并触发细胞死亡反应[34]。采用类似的设计思路,研究人员通过对关键氨基酸的精准突变,相继获得了多个水稻RGA5HMA突变体,不仅能够识别AVR-Pia和AVR1-CO39,也能够识别AVR-PikD、AVR-Pib等新的稻瘟病菌效应蛋白[39,54]。由此说明,基于蛋白质三维结构对直接整合到免疫受体上的诱饵蛋白结构域进行人工分子设计可能具有广泛的应用前景。

近年来,“植物NLR免疫受体及其介导的抗病机制”已成为农业科学和植物学领域的前沿热点。植物抗病小体的发现是植物免疫研究领域25年来里程碑式的进展,引领了领域的发展方向。全长NLR蛋白的结构解析虽然已取得突破,但是其他NLR蛋白的完整结构解析仍然存在挑战。柴继杰教授课题组花费了将近10年的时间才从数量众多的植物NLR蛋白中筛选到了理想的研究对象——ZAR1,全长NLR蛋白的大量表达和纯化并非易事。直接利用植物细胞瞬时表达具生物学功能的NLR全长蛋白及其与病原生物效应蛋白复合物可能是一种可行的策略。

目前,植物NLR蛋白经典保守结构域的三维结构特征基本明确,但是非典型结构域的结构解析数量仍然有限。相对于经典结构域而言,结构生物学家未来可能会更多关注非典型结构域及其与病原生物效应蛋白复合物的结构解析,两者互作界面的直观展示可以为免疫受体的精准改造和人工设计提供丰富的结构信息。除了目前已知的识别功能,非典型结构域是否还具有其他功能?三维结构的解析可为进一步揭示非典型结构域的新功能与新特性提供有价值的线索。

此外,当前关于植物NLR抗病小体的结构生物学研究仍然存在的不少问题值得进一步研究。部分NLR用于直接监测病原生物效应蛋白,被称为sNLR(sensor NLR),需要下游辅助hNLR(helper NLR)才能激活ETI。这类通过sNLR-hNLR工作模式的NLR是否会形成类似NAIP-NLRC4炎症小体的sNLR-hNLR复合物抗病小体?对于TNL来说,下游还依赖于EDS1/PAD4和EDS1/SAG101发挥作用,sNLR-EDS1-hNLR三者是否形成复合物?RGA5/RGA4这类成对发挥功能的NLR激活时是否形成抗病小体?结构生物学将是未来回答这些问题最重要的手段之一。

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