葛根芩连汤抑制特应性皮炎小鼠模型炎症反应及恢复皮肤屏障功能的实验研究
时间：2023-02-24 16:25:07 来源：千叶帆 本文已影响人
李昱达 郑丰杰 王航 张淑静 冯婧 刘锦钢 汤阳 孙燕 李宇航
特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)，又称特应性湿疹，属中医“四弯风”“奶癣”“胎疮”等范畴，其发病与先天禀赋不足、胎毒遗热、脾虚失运，风、湿、热邪蕴结肌肤有关，具有表里同病、虚实夹杂的病证特点[1-2]。
近年来，对肠道与皮肤相互作用对过敏性疾病发病机制认识的日益增加，为治疗AD提供了新的思路与途径[3]，如发现肠道菌群可通过调节免疫系统影响AD的发生发展，使用益生菌影响肠道菌群的组成对AD具有积极影响[4]。《伤寒论》葛根芩连汤具有外解表热、内清湿热之功，为表里双解之剂。现今临床应用葛根芩连汤辨证治疗溃疡性结肠炎、2型糖尿病等为研究热点，其作用机制与炎症因子、肠道菌群、脂联素相关信号通路等相关[5]。本文旨在观察葛根芩连汤对2,4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene,DNFB)反复刺激皮肤诱导致敏的小鼠模型的干预作用，并从改善皮肤屏障功能和调控免疫炎症角度初步探讨其效应机制，以期为中医临床辨证治疗AD提供实验依据。
1.1 实验动物
24只SPF级BALB/c小鼠，6周龄，体质量(20±2)g，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SYXK(北京)2016-0006。适应性饲养7天，自由饮水和进食。所有实验程序和实验动物使用均符合北京中医药大学实验动物伦理委员会规定，伦理批准号：BUCM-4-2021051701-2061。
1.2 实验药物、试剂与仪器
葛根芩连汤由葛根24 g、炙甘草6 g、黄芩9 g、黄连9 g组成[6]，中药材全部购自北京同仁堂药店。常规煎煮后，80℃水浴浓缩为浓度为1 g生药/mL的药液，4℃冰箱储存备用。糠酸莫米松凝胶[规格：0.1%，华润三九(南昌)药业有限公司，批号：2006007J]。
DNFB(美国Sigma公司，批号:M24318031)，丙酮(北京化工厂，批号：20170209)，橄榄油(西班牙 Mueloliva公司，货号：fTYKZEeC)，脱毛膏(英国 Dimples公司，批号：20210621)，二甲苯(天津市凯通化学试剂有限公司，批号：20190325)，无水乙醇(北京化工厂，批号：20200417)，苏木素染色液(中杉金桥，批号：20042002)，伊红染色液(中杉金桥，批号：20060901)；
小鼠血清总免疫球蛋白E (immunoglobulin E，IgE)酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa)试剂盒(批号:KT2056-A)，小鼠血清白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)Elisa试剂盒(批号:KT2163-A)，小鼠血清白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)含量Elisa试剂盒(批号:KT2176-A)，均购自江苏科特生物科技有限公司。细胞组织RNA 提取试剂盒(Qiagen 批号: 74134)；
反转录试剂盒(Thermo ，批号:K1622)；
DNase/RNase-Free 水(索莱宝， 批号:R1600);Power SYBR Green PCR Master Mix荧光定量试剂盒(ABI，批号: 4367659)；
高透光度粘性盖膜 (ABI，批号:4360954)；
MicroAmp®Fast96孔反应板(ABI，批号: 4346906)；
RNA引物(上海英俊生物技术有限公司)；
普通 RIPA裂解液(索莱宝，批号:R0020)；
蛋白酶抑制剂混合液(索莱宝，批号:P6730)；
Filaggrin antibody(Proteintech公司，批号: 0900096)、密封蛋白1 antibody (Bioss公司，批号:AI100918); β-actin antibody(Bioss公司，批号:AH1 1286487)；
HRP标记羊抗兔(Bioss公司，批号:AI100918)。
独立通气笼IVC饲养笼(江苏·苏杭科技器材有限公司)，皮肤多探头测试仪(德国Courage+Khazakz)；
HistoCore全自动封闭式组织脱水机，HistoCore Arcadia H石蜡包埋机，HistoCore Arcadia C组织切片冷台，RM2255全自动切片机，HI1210摊片机和HI1220烤片机均购自德国Leica公司。Revolve FL正倒置一体荧光显微镜(美国Echo公司)，酶标仪(美国Biorad公司)，冷冻高通量组织研磨机(恩茨生物技术公司)，电泳仪器(Bio-Rad公司)，双垂直电泳槽(Bio-Rad公司)，超灵敏多功能成像仪(Azure生物系统公司)，PCR扩增仪(Biorad公司)，StepOnePlus实时荧光定量 PCR仪(ABI公司)。
1.3 分组与造模
采用随机数字表法将24只雄性BALB/c小鼠分为正常组、模型组、对照组(糠酸莫米松治疗)和中药组(葛根芩连汤治疗)。参照文献[7]采用DNFB半抗原反复刺激的方法制备AD小鼠模型。具体方法如下(见图1)：致敏前用电推剪和脱毛膏除去小鼠背部毛发，面积约2.0 cm × 3.0 cm。在1 cm×1 cm的纱布上滴涂2% 的DNFB溶液200 μL，均匀涂抹在背部皮肤，每周2次(即第1、4、8、11天)。14天后改用0.2%的DNFB溶液200 μL，均匀涂抹在背部皮肤，2次/周，第15、18天重复上述操作，持续1周，模型组和各药物治疗组给予上述处理；
正常组小鼠在相应时间点在背部涂抹等量基质溶液(丙酮∶橄榄油=4∶1)。
图1 小鼠AD模型制备流程
1.4 药物干预方法
在实验第22天开始给药。中药组用葛根芩连汤灌胃6.24 g/(kg·d)，每日两次，连续7天；
对照组于小鼠皮损处均匀涂抹适量0.1% 糠酸莫米松凝胶，每日一次，连续7天；
同时，正常组和模型组给予等量常温蒸馏水灌胃，每日两次，连续7天。
1.5 取材方法
于实验第29天，对各组小鼠进行10 %水合氯醛麻醉后，采用摘眼球取血法获得小鼠全血0.5～1 mL，室温静置2小时后，使用4℃离心机，高速离心15分钟，3 000 r/min，抽取血清后置于冰箱保存待测。无菌条件下取小鼠皮损处皮肤组织，取部分皮肤以提取组织蛋白及RNA，其他皮肤组织以4%多聚甲醛溶液固定保存。
1.6 指标观测
1.6.1 皮损评估 于实验第1、7、14、28天，参考湿疹面积及严重程度指数(eczema area and severity index，EASI)[8]评价皮损情况与评估。背部皮损炎症的评价指标:红斑(出血)、水肿、表皮剥脱、鳞屑。0：无症状；
1：轻；
2：中；
3：重。最高为12分。
1.6.2 小鼠搔抓行为观察 观察小鼠一般情况，参照Kuraishi方法[9]，在实验第1、7、21、28天对小鼠搔抓行为进行观察，记录小鼠前后肢对头面部、腹部、背部的搔抓次数并进行统计。
1.6.3 经皮水分流失检测 于实验第1、7、21、28天对小鼠进行经皮失水数值测量。使用皮肤多探头测试仪的Tewameter TM300探头测定小鼠背部皮损处经皮失水率，使用标准测量法，设置测定时间为20秒/次，读取前15秒的平均值。
1.6.4 皮肤pH值 于实验第1、7、21、27天对小鼠进行皮肤pH值检测。使用pH905探头测定皮损及非皮损处 pH值，每次重复检测3次，结果取平均值。保持每次检测时间、室内环境、检测人及其他条件的相对一致性。
1.6.5 皮肤组织病理学 取小鼠剃毛区域皮肤组织，用4%多聚甲醛溶液固定后，将组织标本脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色，显微镜下观察组织病理改变。
1.6.6 血清总IgE、IL-6、IL-10水平检测 使用ELISA试剂盒进行血清相关指标检测，具体步骤参考试剂盒说明书进行。反应结束后，使用酶标仪在450 nm测量96孔板中各孔样本的吸光值(OD值)，根据标准曲线，计算样本浓度。
1.6.7 丝聚合蛋白、密封蛋白1 mRNA表达 在皮肤组织中加入适量的裂解液和研磨珠，放入冷却组织研磨机粉碎，用RNA提取试剂盒取组织上清液，测定浓度并逆转录为cDNA。将 GAPDH 作为内参，SYBR Green 作为染料进行荧光定量 PCR 扩增。反应体系为20 μL，反应条件为：95 ℃预变性10 分钟；
95 ℃变性5秒，60 ℃退火30秒，40个扩增循环；
熔解曲线放大，95℃ 15秒，60℃ 1分钟；
在 95 ℃下延长15秒。通过计算2-ΔΔCt法进行相对表达量分析。引物序列见表1。每组随机取3只小鼠的皮肤组织进行检测。
表1 引物序列
1.6.8 丝聚合蛋白、密封蛋白1的蛋白表达 在皮肤组织中加入适量的含有苯甲磺酰氟的组织裂解液和研磨珠，放入组织研磨机粉碎，离心提取组织上清液并通过变性buffer使其变性。SDS-PAGE电泳分离蛋白质，并进行恒压转膜，5%脱脂奶粉封闭，孵育一抗过夜、TBST洗3次，孵育二抗，TBST洗3次，显色、拍照。运用Image J软件分析灰度值，并计算与目标蛋白灰度值/β-actin灰度值的相对表达。每组随机取3只小鼠的皮肤组织进行检测。
1.7 统计学处理
2.1 小鼠皮损评估
用2%DNFB丙酮、橄榄油溶液刺激后，小鼠情绪躁动不安，频繁搔抓背部，背部皮肤出现轻微红斑、水肿、小面积表面剥脱等表现。
随着涂抹次数的增加, 出现红斑加重、皮肤结痂并伴有干燥、脱屑、皮肤肥厚增生等慢性改变。给药后，与模型组比较, 中药组、对照组小鼠背部皮损的红斑、结痂逐渐消退，皮肤肥厚增生较少。
造模第1、7、21天，与正常组相比，模型组皮损程度严重(P<0.05)；
与模型组相比，中药组、对照组皮损程度无明显差异(P>0.05)。第28天，与正常组相比，模型组皮损程度严重(P<0.05)；
与模型组相比，中药组、对照组皮损显著改善(P<0.05)。见表2，图2。
表2 各组AD小鼠皮损严重程度评分比较分)
注：A 正常组；
B 模型组；
C 中药组；
D 对照组。
2.2 搔抓行为观察
在各组小鼠造模的第1天，观察其30分钟内搔抓次数。与正常组比较，模型组搔抓次数明显增高(P<0.05)；
与模型组相比较，中药组、对照组搔抓次数无明显差异(P>0.05)。造模的第7、21天，观察其30分钟内搔抓次数，与正常组比较，模型组搔抓次数明显增高(P<0.05)；
与模型组相比较，中药组、对照组搔抓次数无明显差异(P>0.05)。造模第28天观察其30分钟内搔抓次数，与正常组比较，模型组搔抓次数明显增高(P<0.05)；
与模型组相比较，中药组、对照组搔抓次数有明显减少(P<0.05)。见表3。
表3 各组AD小鼠30分钟内搔抓次数比较次)
2.3 经皮水分流失分析
造模第1天，与正常组相比，模型组经皮失水升高(P<0.05)；
与模型组相比，中药组、对照组无明显差异(P>0.05)。第7、14、21天，与正常组相比，模型组经皮失水显著升高(P<0.05)；
与模型组相比，中药组、对照组无明显差异(P>0.05)。第28天，与正常组相比，模型组经皮失水升高(P<0.05)；
与模型组相比，中药组、对照组经皮失水明显下降(P<0.05)。见表4。
表4 各组AD小鼠经皮失水比较
2.4 皮肤pH值
造模第1、7、21天，与正常组相比，模型组皮肤pH值显著升高(P<0.05)；
与模型组相比，中药组、对照组皮肤pH值无明显差异(P>0.05)；
第27天，与正常组相比，模型组皮肤pH值显著升高(P<0.05)；
与模型组相比，中药组、对照组皮肤pH值明显下降(P<0.05)。见表5。
表5 各组AD小鼠皮肤pH值比较
2.5 皮肤组织病理学观察
治疗后，正常组表皮及真皮各层结构完整且正常;模型组表皮层不完全角化，颗粒层和棘层增厚，表皮、真皮层均有大量炎细胞浸润;中药组及对照组小鼠表皮层角化不全严重程度较轻，颗粒层、棘层轻微增厚，中等量炎细胞浸润。见图3。
注：A 正常组；
B 模型组；
C 中药组；
D 对照组。
2.6 血清总IgE、IL-6、IL-10
血清总IgE水平:与正常组相比，模型组数值较高，存在显著差异(P<0.05)；
与模型组相比，中药组、对照组IgE数值均明显降低(P<0.05)。血清IL-6水平:与正常组相比，模型组数值较高，存在显著差异(P<0.05)；
与模型组相比，中药组、对照组IL-6数值均明显降低(P<0.05)。血清IL-10:与正常组相比，模型组明显降低(P<0.05)；
与模型组相比，中药组与对照组无显著差异(P>0.05)。见表6。
表6 各组AD小鼠血清总IgE、IL-6、IL-10水平比较
2.7 皮肤组织丝聚合蛋白、密封蛋白1 mRNA表达
与正常组相比，模型组丝聚合蛋白的mRNA表达显著降低(P<0.05)，密封蛋白1的mRNA表达明显降低(P<0.05)；
与模型组相比，中药组与对照组各指标mRNA表达均明显升高(P<0.05)。结果见表7。
表7 各组AD小鼠皮肤组织丝聚合蛋白、密封蛋白1 mRNA表达情况
2.8 皮肤组织丝聚合蛋白、密封蛋白1蛋白表达
与正常组相比， 模型组丝聚合蛋白的蛋白含量显著降低(P<0.05)，密封蛋白1的蛋白含量明显降低(P<0.05)；
与模型组相比，中药组与对照组各指标蛋白含量均明显升高(P<0.05)。结果见表8，图4。
表8 各组AD小鼠皮肤组织丝聚合蛋白、密封蛋白1 蛋白表达情况
注：A 正常组；
B 模型组；
C 中药组；
D 对照组。
AD确切病因及发病机制尚未完全阐明，目前占主导地位的是美国学者Peter M. Elias提出的“内外串扰病机学说”，即AD发生发展是在皮肤屏障功能受损基础上，变应原引发免疫功能紊乱和调节失衡，导致过敏性炎症反应；
而异常免疫炎症反应进一步破坏皮肤屏障。内外串扰，形成恶性循环，导致本病迁延难愈[10-11]。现今临床治疗AD，主张改变生活习惯、避免接触过敏原、外用保湿润肤剂等基础治疗，轻中度患者可局部外用糖皮质激素、钙调神经磷酸酶抑制剂、磷酸二酯酶4等缓解或消除症状，重度患者口服抗组胺药物、免疫抑制剂、系统应用糖皮质激素等[12]；
寻找和研究治疗AD作用确切、副作用低的有效方药或成分，一直是皮肤科学领域的研究热点。
AD属于中医学“奶癣”“胎敛疮”“四弯风”“血风疮”“浸淫疮”等病证范畴，中医学对其病因病机的认识和治疗积累了丰富经验，中医中药或中西医结合辨证治疗AD安全有效，且具有不易复发、不良反应发生率低等优势[13-15]。世界中医药联合会皮肤科专业委员会2021年发布的特应性皮炎中医诊疗指南中[1]，将AD分为心脾积热、心火脾虚、脾虚湿蕴、风湿热蕴、脾虚血燥、脾肾阳虚6个证型辨证施治，并提出AD急性期治疗当以祛除蕴结在肌肤之风湿热邪为要，辅以健脾祛湿，推荐选用三心导赤饮、培土清心方、小儿化湿汤、消风散等加减，侧重从心、脾两脏论治。有学者提出基于“肺主皮毛”理论，运用宣、补、润、清等法从肺论治AD[16]。本课题组采用经方麻黄连轺赤小豆汤加减辨治AD证属风湿热邪蕴结肌肤者，临床疗效满意，并从调控非组胺依赖性神经信号传导、皮肤屏障功能等方面探讨了其效应机制[17-19]。
“皮应大肠”是中医学藏象学说代表性理论之一。对此，《灵枢·本藏》云：“大肠者，皮其应”“皮厚者，大肠厚，皮薄者，大肠薄；
皮缓，腹里大者，大肠大而长；
皮急者，大肠急而短；
皮滑者，大肠直；
皮肉不相离者，大肠结”，强调了皮肤与大肠生理上相互联系、病理上相互影响。多项临床研究证实肠道疾病与皮肤病存在共病风险：2020年韩国一项基于全国人群的研究发现，患AD可导致克罗恩病与溃疡性结肠炎患病风险增加[20]；
2021年又一项前瞻性队列研究表明，特应性皮炎、银屑病和酒糟鼻患者克罗恩病的发病风险增加[21]。这些研究为中医“皮应大肠”理论和皮肤病从肠论治提供了临床证据和思路。
葛根芩连汤出自《伤寒论》，主治太阳病误用攻下、里热挟表邪下利证，是后世用以治协热下利的代表方剂，现今临床多用其治疗肠炎、结肠炎等肠道炎症证属湿热者。需要指出的是，《伤寒论》第34条原文中“下利”“脉促”“喘而汗出”不仅反映了里(肠、肺)热挟表邪为病的特点，而且以主症“下利”强调邪热在“肠”，以兼症“喘而汗出”提示邪热在“肺”“皮毛”间攻冲串扰，故亦可用于治疗呼吸、皮肤相关疾病。
经皮失水、皮肤pH值是检测皮肤屏障的无创指标，两者都可反映出皮肤屏障是否出现功能障碍。研究表明AD患者的经皮失水及皮肤pH值均有升高[22]。丝聚合蛋白参与表皮角质形成细胞的分化，对皮肤屏障的形成发挥关键作用。密封蛋白1是紧密连接的重要组成，其可维持皮肤屏障完整性。有实验研究表明当密封蛋白1水平下降到阈值，会导致紧密连接和表皮屏障功能受损，并发生AD[23]。本课题研究表明，葛根芩连汤用于治疗AD模型小鼠有较好疗效，可有效缓解小鼠背部皮肤损伤情况，减少小鼠搔抓次数，降低经皮水分流失及皮肤pH值，抑制炎症反应并可提高小鼠皮肤组织丝聚合蛋白、密封蛋白1含量从而改善皮肤屏障功能，为进一步深入探讨葛根芩连汤从肠防治AD的相关机制奠定了实验基础。
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