黏质沙雷菌非特异性核酸内切酶通用型定量检测方法的建立及验证
时间：2023-02-24 17:45:05 来源：千叶帆 本文已影响人
毕华，朱香，卢宁，牛林茹，杨凌，张晓峰，周勇，梁雅丽
1.中国食品药品检定研究院重组药物室，北京 100050；
2.山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030000；
3.山西集创生物科技有限公司，山西 太原 030000；
4.君研生物科技（山西）有限公司，山西 太原 030000
黏质沙雷菌（Serratia marcescens）Benzonase®核酸内切酶（Serratia marcescensBenzonase®endonuclease，SMBE）为黏质沙雷菌非特异性核酸内切酶，可降解各种形式的核酸［1-3］，多用于生物制品中核酸的去除［4-5］。该酶对宿主细胞具有毒性，可导致多种临床不良反应的发生［6-7］。在溶瘤腺病毒及腺病毒相关产品质量控制中，规定残留SMBE应不高于1 ng／支［8-9］。目前，采用qPCR法（检测范围≥1.5 ng／mL）或ELISA法（检测范围≤1 ng／mL）可定量检测SMBE 残留量，与qPCR 法比较，ELISA 法的灵敏度较高。目前，市场上常规ELISA 检测试剂盒中的抗原均为含有完整氨基酸序列的SMBE，仅能用于检测1～2 种使用SMBE 的产品，为非通用型检测试剂盒，无法满足市场需求。同时，完整氨基酸序列的SMBE 有酶活性，对免疫系统有毒性作用，可导致机体免疫抑制或免疫刺激、过敏反应及自身免疫反应，对机体存在潜在危害，不适合用于免疫［10-11］。
据报道，将SMBE 第110 位组氨酸突变为丙氨酸，可在不改变SMBE 蛋白结构的同时降低其酶活性［12］。本研究通过制备突变体SMBE 蛋白，并以其为抗原免疫家兔，制备包被及检测抗体，建立SMBE通用型定量ELISA检测方法，以期用于多种不同SMBE产品残留的定量检测，满足市场需求。
1.1 基因、载体及菌株 根据文献［5，12-13］方法，由武汉擎科生物科技有限公司合成SMBE第110位组氨酸突变为丙氨酸的突变体SMBE基因BEHA；
载体pET-20b（+）购自武汉擎科生物科技有限公司；
E.coliBL21（DE3）pLysS购自北京百奥莱博科技有限公司；
感受态E.coliDH5α由山西生物研究院有限公司提供。
1.2 样品 SMBE 分别购自杭州俊丰生物工程有限公司（JUNFENG）、自翌圣生物科技（上海）有限公司（YEASEN）及德国Merck公司（分别为样品1、2、3）。
1.3 主要试剂及仪器 NcoⅠ、HindⅢ及T4 DNA 连接酶购自美国NEB 公司；
质粒小提试剂盒Plasmid Mini KitI（100）购自美国OMEGA公司；
LB培养基由山西生物研究院有限公司提供；
IPTG 及鲑鱼精DNA 购自北京索莱宝生物科技有限公司；
Ni-NTA 琼脂糖纯化树脂和层析重力柱（柱体积2 mL）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
抗体标记试剂盒购自同仁化学研究所；
用于比较的SMBE定量检测试剂盒为市售产品；
SMBE 标准品和SMBE 蛋白（纯度＞95%）均由山西集创生物科技有限公司提供，并由该公司完成蛋白浓度和酶活测定及标准品的溯源。
1.4 目的基因扩增 根据NCBI 中登录的SMBE基因（M19495.1）序列，应用Primer-Blast 软件设计引物，上游引物：5′-CATGCCATGGATCATCACCATCACCATCACGACACGCTCGAATCCATCGAC-3′（下划线部分为NcoⅠ酶切位点，斜体部分为6 个组氨酸标签序列），下游引物：5′-CCCAAGCTTTCAGTTTTTGCAGCCCATCAACT-3′（下划线部分为HindⅢ酶切位点），扩增产物大小为1 019 bp。以突变体SMBEBEHA基因为模板进行PCR 扩增。PCR 反应条件为：98 ℃预变性30 s；
98 ℃10 s，57 ℃30 s，72 ℃1 min，共30 个循环；
72 ℃再延伸2 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.5 重组表达质粒的构建 将载体pET-20b（+）及PCR 产物均经NcoⅠ及HindⅢ双酶切后，回收载体及目的基因片段，以T4 DNA 连接酶于16 ℃连接过夜；
连接产物转化感受态E.coliDH5α，涂布于含100 μg／mL 氨苄青霉素的LB 琼脂平板，37 ℃培养过夜；
挑取12 个单菌落（1～12 号）进行菌落PCR 检测，将鉴定正确的单个菌落送北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的即为阳性克隆菌株。用Plasmid Mini KitI（100）提取阳性克隆菌株的质粒，转化感受态E.coliBL21（DE3）pLysS，涂布于含50 μg／mL氨苄青霉素及34 μg／mL 氯霉素的LB 琼脂平板，37 ℃培养过夜；
获得BEHA 工程菌株，加入50%甘油，于-80 ℃保存。
1.6 BEHA 的表达及纯化 挑取BEHA 工程菌株单菌落，接种至20 mL 含50 μg／mL 氨苄青霉素和34 μg／mL氯霉素的LB 培养基，于37 ℃，210 r／min摇床培养过夜；
按1∶100 的比例转接至100 mL 含50 μg／mL 氨苄青霉素和34 μg／mL 氯霉素的LB 培养基，继续培养3 ～4 h；
待A600为1.0 ～1.2时，加入IPTG至终浓度1 mmol／L，于25 ℃诱导16 h；
10 000×g离心15 min，收集上清。采用Ni-NTA 琼脂糖纯化树脂亲和层析重力柱（柱体积2 mL）进行一步纯化，纯化产物经15%SDS-PAGE和分光光度计分析。
1.7 BEHA 酶活性的检测 用分析液（50 mmol／L Tris-HCl，5 mmol／L MgCl2，pH 8.0）将10 mg／mL 的鲑鱼精DNA 稀释至48、24 和12 μg／mL，加入纯化的BEHA（250 ng），同时设阳性对照（250 ng纯度＞95%的SMBE 蛋白与48 μg／mL 鲑鱼精DNA 作用）及空白对照（不加BEHA，仅加各浓度的鲑鱼精DNA），于37 ℃水浴30 min，进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.8 包被抗体及检测抗体的制备 委托南京金斯瑞生物科技有限公司制备的BEHA 为抗原，免疫家兔，制备BEHA 多克隆抗体，检测抗体效价（高于1∶5×104），作为包被抗体。以用抗体标记试剂盒标记HRP的BEHA多克隆抗体作为检测抗体。
1.9 SMBE 双抗体夹心ELISA 检测方法的建立 用包被缓冲液（0.05 mol／L 碳酸盐缓冲液，pH 9.6）将包被抗体稀释至终浓度为2 μg／mL，加入96 孔板，100 μL／孔，4 ℃包被过夜；
用洗涤缓冲液（0.15 mol／L PBS，0.05%Tween-20，pH 7.4）洗涤3 次，加入封闭液（0.15 mol／L PBS，0.5%酪蛋白，0.05%Tween-20，pH 7.4），200 μL／孔，室温放置1.5 h；
洗涤缓冲液洗涤3 次，加入SMBE 标准品或待检样品，100 μL／孔，37 ℃孵育0.5 h；
洗涤缓冲液洗涤3次，加入BEHA 检测抗体（1∶40 000 稀释），100 μL／孔，于37 ℃反应0.5 h；
洗涤液洗涤3次，加入显色液，37 ℃作用15 min；
加入2 mol／L H2SO4，100 μL／孔，终止反应，用酶标仪检测A450。
1.10 方法的验证
1.10.1 线性范围 用稀释液（0.15 mol／L PBS，0.05%Tween-20，0. 5% BSA，pH 7. 4）将SMBE 标准品稀释为20、8、3.2、1.28、0.51、0.20、0 ng／mL，按1.9 项方法检测，每个浓度设2个复孔，以2孔的平均A450减去空白孔的A450作为矫正值。以SMBE 标准品的A450为因变量Y，标准品浓度为自变量X建立曲线四参数Logisitic数学模型拟合。至少重复测定3次。
1.10.2 准确度 用稀释液将SMBE 标准品稀释为16、10、0.6 ng／mL，按1.9 项方法检测，重复测定3次，取平均值，并按下式计算测量偏差，即准确度。
测量偏差（%）=（平均值-理论值）／理论值×100%
1.10.3 精密性 用稀释液将SMBE标准品稀释为12和2 ng／mL，按1.9项方法重复检测10次，计算检测结果的平均值（M）、标准差（SD），并按下式计算变异系数（CV）。
CV（%）=SD／M×100%
1.10.4 定量限 用稀释液将SMBE 标准品稀释为0.2 ng／mL，按1.9 项方法重复检测10 次，计算检测结果的M、SD，并计算CV。
1.11 与其他检测方法的比较 采用本研究建立的双抗体夹心ELISA 法及市售SMBE 定量检测试剂盒分别检测样品1（2 ng／mL）、样品2（3 ng／mL）及样品3（1.5 ng／mL），重复检测3次。
2.1 目的基因扩增产物的鉴定BEHA基因PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1 019 bp 的目的基因条带，大小与预期一致，见图1。
图1 BEHA基因PCR 产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of BEHA gene
2.2 重组表达质粒的鉴定 菌落PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，1、2、4～12号单菌落可见1 019 bp的目的条带，大小与预期一致，见图2。测序结果表明，5号单菌落为阳性克隆菌株。将该测序结果与原始基因序列比较，除第110 位组氨酸突变为丙氨酸的相应基因序列发生改变外，其他序列完全一致，见图3。上述结果表明，重组表达质粒构建正确。
图2 菌落PCR产物电泳图Fig.2 Electrophoretic profile of colony PCR products
图3 BEHA基因序列分析Fig.3 Analysis of BEHA gene sequence
2.3 BEHA 纯化产物的鉴定 BEHA 纯化产物相对分子质量约30 000，纯度达95%以上，见图4。纯化产物表达量为3 mg／100 mL。
图4 BEHA纯化产物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified BEHA
2.4 BEHA 的酶活性 与空白对照比较，SMBE 可完全消化48 μg／mL 的鲑鱼精DNA，BEHA 消化48、24 和12 μg／mL 鲑鱼精DNA 的效果较差，见图5。表明与SMBE 酶活性比较，BEHA 酶活性大幅降低。
图5 BEHA酶活性测定电泳图Fig.5 Electrophoretic profile of BEHA enzyme activity
2.5 方法的验证
2.5.1 线性范围 SMBE 标准曲线见图6。SMBE 标准品在0 ～20.00 ng／mL范围内与A450呈良好的线性关系，回归方程为Y=（5.392 77 - 0.035 39）／［1 +（X／28.095 32）-1.16658）］+0.035 39，R2=1.000。
图6 SMBE的标准曲线Fig.6 Standard curve of SMBE
2.5.2 准确度 16、10、0.6 ng／mL 的SMBE 标准品重复检测3次的偏差分别为-3.06%、-5.40%、3.33%，见表1。表明该方法具有良好的准确度。
表1 准确度验证结果Tab.1 Verification of accuracy
2.5.3 精密性 12 和2 ng／mL 的SMBE 标准品重复10 次检测结果的M分别为12. 49 和2. 06 ng／mL，SD分别为0. 31 和0. 06 ng／mL，CV分别为2.48%和2.91%。表明该方法具有良好的精密性。
2.5.4 定量限 0.2 ng／mL 的SMBE 标准品重复检测10 次的M为0.21 ng／mL，SD为0.02 ng／mL，CV为9.52%，测量偏差为5.00%。确定定量限为0.2 ng／mL。
2.6 与其他检测试剂盒的比较 本研究建立的方法检测样品1、2 和3 的结果分别为1.92、2.93 和1.46 ng／mL，市售试剂盒检测样品1、2 和3 的结果分别为0.08、0.00 和1.57 ng／mL。本研究建立方法的检测结果更接近样品理论值，表明该方法可定量检测多种市售SMBE 产品，是一种SMBE 通用型定量检测方法。
SMBE作为核酸消化剂广泛应用于生物制品，其残留需严格控制。有研究表明，以病毒为载体相关产品的生产工艺流程中加入SMBE 能有效去除宿主DNA 残留如宫颈癌疫苗GARDASIL 的工艺流程中使用SMBE 处理病毒颗粒（4 ℃过夜），可有效控制终端产品中宿主DNA 残留量［2，4，14-15］；
Canji、Bioreliance、Introgen 及Puresyn 公司在腺病毒生产过程中也加入SMBE 用于腺病毒产品核酸去除［8］。《生物技术药物研究开发和质量控制》“非复制型病毒载体类基因治疗药物”章节中提到在重组腺病毒产品生产工艺中用SMBE去除重组腺病毒产品中的核酸，且在重组人p53腺病毒注射液及溶瘤腺病毒产品（SG600-P53）质量控制中明确规定，SMBE 残留应不高于1 ng／支［9］。SMBE 可消化各种类型的核酸，具有一定毒性，可损害动物免疫系统，产生免疫毒性，影响抗原免疫效果，使收获的抗体质量差，不能作为ELISA 检测中的包被及检测抗体［16-18］。另有研究表明，蛋白质变性后，构象及其表面的抗原决定簇也会随之改变［19-23］，免疫动物获得的抗体也不能作为ELISA 检测所需抗体。因此，需在确保重组蛋白在不改变SMBE 构象的前提下降低其酶活性，才可作为抗原免疫动物，制备高质量的抗体。
本研究构建了BEHA 重组表达质粒，经菌落PCR 鉴定构建正确，且测序结果表明，其第110 位组氨酸已成功突变为丙氨酸。将BEHA 重组表达质粒转化E.coliBL21（DE3）pLysS，IPTG诱导表达BEHA，通过一步Ni-NTA 琼脂糖纯化树脂纯化，获得的纯化产物纯度＞95%，且酶活性大幅降低，产量高达3 mg／100 mL。上述结果表明，纯化BEHA 可用于免疫动物制备抗体。以纯化BEHA 作为抗原，委托南京金斯瑞生物科技有限公司通过免疫家兔制备包被抗体及检测抗体，成功建立SMBE 双抗体夹心ELISA 法。SMBE 标准品浓度在0～20 ng／mL 范围内与A450呈良好的线性关系，R2= 1.000；
SMBE 标准品浓度为16、10、0.6 ng／mL 的测量偏差分别为-3.06%、-5.40%、3.33%；
SMBE 标准品浓度为12 和2 ng／mL 的精密性CV分别为2.48%和2.91%。表明建立的方法具有良好的准确度和精密性，方法检测下限为0.2 ng／mL。与市售同类产品比较，本研究建立方法的检测结果更接近理论值，表明这是一种SMBE 通用型定量检测方法，可用于不同产家相关生物制品工艺质量的控制，满足市场需求。
