特应性皮炎患儿外周血miR-155,表达与Th1/,Th17,细胞及相关细胞因子的相关性分析
时间：2023-02-24 22:50:04 来源：千叶帆 本文已影响人
周晓宇 罗 亭 王润超
湖北省十堰市太和医院皮肤科，湖北十堰 442000
特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是慢性炎症性皮肤病，可引起患者剧烈瘙痒，多发于婴幼儿期，随着年龄增长患病率降低[1-4]。AD 发病与遗传、表皮屏障破坏和免疫系统失调等因素有关[5]。辅助性T 细胞（T helper cell，Th cell）1、Th17 通过分泌细胞因子调控其他免疫细胞的活化和增殖，AD 患儿中Th1/Th17存在明显失衡，Th17 细胞处于主导地位[6]。微RNA（micro RNA，MiR）-155 是一种重要的免疫系统调节剂，可靶向特定基因影响免疫细胞表型和细胞因子水平[7-8]。鉴于此，本研究拟探讨miR-155 表达与Th1/Th17 的关系，以期为临床诊治提供参考。
1.1 一般资料
选择2018 年2 月至2021 年9 月湖北省十堰市太和医院（以下简称“我院”）收治的89 例AD 患儿为AD 组，其中男49 例，女40 例；
年龄2 个月～6 岁，平均（3.02±1.59）岁；
体重指数14.5～17.3 kg/m2，平均（15.35±1.26）kg/m2。纳入标准：①符合《中国儿童特应性皮炎诊疗共识（2017 版）》[9]；
②年龄1 个月～12 岁；
③患儿家属知情同意。排除标准：①湿疹、脂溢性皮炎；
②麻风、疥疮、真菌病、皮肤细菌感染；
③系统性自身免疫疾病。根据特应性皮炎评分指数[10]将AD 患者分为轻度组（0～24 分，28 例）、中度组（＞24～50 分，37 例）、重度组（＞50 分，24 例）。另选择同期我院体检的25 名健康儿童为对照组，其中男15 名，女10 名；
年龄1 个月～7 岁，平均（3.11±1.62）岁；
体重指数14.2～16.7kg/m2，平均（14.93±1.17）kg/m2。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究经我院伦理委员会批准（2018-014）。
1.2 研究方法
所有受试者入组后24 h 内采集静脉血6 ml，离心（相对离心力为699 g，离心半径为15 cm）取上清液。miR-155 检测：取外周全血样本100 μl，采用Direct-Zol RNA MiniPrep（美国Zymo Research 公司，批号：190535）试剂盒分离总RNA，Nanodrop 分光光度计获得A260/A280比值为1.8～2.1 的RNA，采用Prime-ScriptTNRT 试剂盒（日本TaKaRa 公司，批号：J02415）将总RNA 逆转录成cDNA。LightCycler 480®实时PCR 仪（瑞士罗氏公司）和PCR SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（日本TaKaRa 公司，批号：GF0527）进行PCR 反应，引物由Primer 5.0 软件设计并由Sangon（China）合成。miR-155 正向引物：5’-CTCGTGGTTAATGCTAATTGTGA -3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；
U6 正向引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，反向引物：5’-CGAATTTGCGTGTCATCCTTG-3’。PCR 反应体系：Power SYBR®Green PCR Master Mix 2.5 μl，cDNA（12.5 ng）引物2 μl，RNase-Free ddH2O 21 μl。反应条件：95℃15 min，然后是40 个循环94℃15 s，55℃30 s，70℃30 s。2-ΔΔCT法计算miR-155 相对表达量。
Th1/Th17 检测：取肝素抗凝试管标本，加入荧光标记的鼠抗人CD4 抗体，APC 标记的鼠抗人白细胞介素（interleukin，IL）-7 抗体，PE 标记的鼠抗人RORγt抗体（武汉艾美捷科技有限公司，批号：203521），磷酸盐缓冲液重悬，CytoFLEX 流式细胞仪（美国Becton Dickinson 公司）检测Th17 细胞占比、Th1 细胞占比，计算Th1/Th17。
Th1、Th17 相关细胞因子检测：取血清样本，Varioskan LUX 多功能酶标仪（美国赛默飞公司）应用酶链免疫吸附试验法检测Th1 细胞因子γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2，Th17 细胞因子IL-17和IL-23 水平，试剂盒购于美国赛默飞公司（批号：AF0268）。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0 软件进行数据分析。计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；
两组间比较采用独立样本t 检验。计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson相关性分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 AD 组与对照组miR-155、Th17 和Th1 细胞占比、Th1/ Th17 比较
AD 组miR-155 表达、Th17 细胞占比高于对照组，Th1 细胞占比、Th1/Th17 低于对照组（P ＜0.05）。见表1。
表1 AD 组和对照组miR-155、Th17 和Th1 细胞占比、Th1/Th17 比较（）
表1 AD 组和对照组miR-155、Th17 和Th1 细胞占比、Th1/Th17 比较（）
注AD：特应性皮炎；
miR：微RNA；
Th：辅助性T 细胞
2.2 AD 组与对照组Th1、Th17 相关细胞因子比较
AD 组IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17 低于对照组，
IL-17、IL-23 高于对照组（P ＜0.05）。见表2。
表2 AD 组与对照组Th1、Th17 相关细胞因子比较（）
表2 AD 组与对照组Th1、Th17 相关细胞因子比较（）
注AD：特应性皮炎；
IFN-γ：γ 干扰素；
IL：白细胞介素
2.3 AD 不同严重程度亚组miR-155、Th17 和Th1 细胞占比、Th1/ Th17 比较
重度组miR-155 表达，Th17 细胞占比高于轻度组和中度组，Th1 细胞占比、Th1/Th17 低于轻度组和中度组；
中度组miR-155 表达，Th17 细胞占比高于轻度组，Th1 细胞占比、Th1/Th17 低于轻度组（P ＜0.05）。见表3。
表3 AD 不同严重程度亚组miR-155、Th17 和Th1 细胞占比、Th1/Th17 比较（）
表3 AD 不同严重程度亚组miR-155、Th17 和Th1 细胞占比、Th1/Th17 比较（）
注：与轻度组比较，aP ＜0.05，与中度组比较，bP ＜0.05。AD：特应性皮炎；
miR：微RNA；
Th：辅助性T 细胞
2.4 AD 不同严重程度亚组Th1、Th17 相关细胞因子比较
重度组IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17 低于轻度组和中度组，IL-17、IL-23 高于轻度组和中度组；
中度组IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17 低于轻度组，IL-17、IL-23 高于轻度组（P ＜0.05）。见表4。
表4 AD 不同严重程度亚组Th1、Th17 相关细胞因子比较（）
表4 AD 不同严重程度亚组Th1、Th17 相关细胞因子比较（）
注 与轻度组比较，aP ＜0.05；
与中度组比较，bP ＜0.05。AD：特应性皮炎；
IFN-γ：γ 干扰素；
IL：白细胞介素
2.5 miR-155 与Th1、Th17 及其相关细胞因子的相关性分析
AD 组患儿miR-155 表达与Th17 细胞占比、IL-17、IL-23 呈正相关（r=0.541、0.402、0.295，P ＜0.05），与Th1 细胞占比、Th1/Th17、IFN-γ、IL-2、IFN-γ/IL-17呈负相关（r=-0.571、-0.607、-0.432、-0.321、-0.409，P ＜0.05）。
AD 与皮肤屏障功能受损和特应性背景有关，刺激物、接触过敏原、食物等均可诱发AD[11-12]。免疫反应在AD 发病机制中发挥关键作用，T 淋巴细胞亚群间不平衡导致细胞介导的免疫反应改变，促进免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导的超敏反应，引起表皮炎症和屏障功能障碍[13-14]。miRNA 与免疫和炎症疾病密切相关，可通过激活先天免疫细胞，引起慢性炎症来促进哮喘、过敏性鼻炎和AD 等疾病的发展[15]。
miR-155 是来源于B 细胞整合簇基因的一个外显子，与信使RNA3’UTR 结合调控基因表达，免疫细胞发育和适应性免疫应答[16]，通过靶向c-Fos 促使树突细胞成熟，上调抗原呈递细胞表面主要组织相容性复合体Ⅱ和共刺激分子表达，间接激活CD4+T 细胞并促使初始CD4+T 细胞增殖分化[17]。有报道显示，miR-155 分别通过靶向含SH2 结构域的肌醇5-磷酸酶1和细胞因子信号抑制因子-1 激活巨噬细胞，诱导脓毒症急性肺部炎症反应[18]。在过敏性鼻炎中，下调miR-155 可调控其下游靶标GATA 连接蛋白3，抑制Th2 细胞因子减轻过敏性反应[19]。miR-155 还通过调节活性氧-环氧合酶-2 轴参与哮喘气道炎症反应[20]。本研究结果显示，miR-155 在AD 患儿外周血中表达上调，且随着病情加重表达增加，提示miR-155 过表达与AD 发病和病情进展可能有关。动物研究显示，AD 小鼠miR-155 表达，IgE、肿瘤坏死因子-α、IL-6水平均增高[21]，Bergallo 等[22]研究显示，AD 患儿miR-155 表达增高且与AD 免疫失调有关。
本研究结果显示，miR-155 过表达与AD 患儿Th1/Th17 失衡有关。Th17 是能分泌IL-17 的T 淋巴细胞亚群，其产生的IL-17 能有效介导中性粒细胞激活，诱发炎症反应。Th1 参与细胞免疫调节，辅助细胞毒性T 细胞分化，介导细胞免疫应答等[23]。本研究结果显示，AD 患儿Th1/Th17 向Th17 偏移，与王相华等[24]报道类似。可能是因为miR-155 通过下调细胞因子信号抑制因子-1 的表达来增强Th17 细胞分化，还可通过靶向IFN-γ 受体α 链促进Th1 细胞极化，调控Th1/Th17 平衡[17]。因此，miR-155 过表达可能引起Th17过度分化，导致Th1/Th17 失衡，当敲除miR-155 后则可抑制Th17 细胞分化，抑制T 细胞介导的炎症反应，恢复Th1/Th17 平衡[25]。
综上，AD 患儿外周血miR-155 表达增高，miR-155 高表达与Th1/Th17 失衡及Th1、Th17 相关细胞因子异常有关；
miR-155 可能通过调节Th1/Th17参与AD 发病过程。本研究不足之处在于样本量较少，尚需进一步扩大样本例数加以证实。
