一种C57BL/6小鼠的dMCAO模型建立及评估*
时间：2023-02-26 16:00:06 来源：千叶帆 本文已影响人
康 敏 ，薛 慧，张 鑫
(1.包头医学院，内蒙古 包头 014040; 2.包头市中心医院神经内科)
脑卒中是世界上第二大死亡和致残原因[1-2]，缺血性脑卒中约占其中的69.6 %～70.8 %[3]。大脑中动脉是缺血性脑卒中主要的责任血管[4]，一直颇受关注。据报告显示，大脑中动脉M2段闭塞发病率为4 %，但仍具有近27 %致死率和57 %致残率[5]。而目前有效的治疗手段针对该段血管及以上的作用极为有限[6-8]，M2段血管及以上对新治疗手段的需求更为迫切。寻求疾病治疗方法，对其机制的研究是必要的，相关动物模型的建立必不可少。
远端大脑中动脉闭塞(Distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)模型是在经颅大脑中动脉闭塞模型的基础上发展而来，模型的闭塞位置相当于大脑中动脉M2段及以上[9]，为研究M2段及以上血管闭塞机制提供更为相近动物模型。同时该模型梗死核心周围可见清晰的半暗带；
较线栓法模型梗死面积小；
动物存活时间长的优势[9-11]，这些都为神经保护、神经可塑类药物及其他新疗法提供了便利。Hermann DM等[9]认为线栓法导致的脑损伤程度较大，有高估了神经保护性药物疗效的可能。Candelario-Jalil E等[12]指出老年啮齿动物的dMCAO模型较管腔内闭塞模型有更高存活率，有利于老年和共病动物的缺血性脑卒中研究。Zuo XL等[13]指出dMCAO模型诱导的缺血性脑卒中导致与原发性病变有突触连接的非缺血性远程脑区的神经病理损害,可能为缺血性脑卒中提供新的治疗思路。较线栓法模型，dMCAO模型拥有不可替代的优势，但线栓法模型运用却远大于dMCAO模型。
大脑中动脉远端血管变异大，限制dMCAO模型的运用[9]。而相较于大鼠，小鼠制备模型时手术视野更狭小，而为了减少损伤，术中只暴露部分大脑中动脉，使得判断大脑中动脉走形及选择闭塞部位极为困难。Kuraoka M等[14]采用单次电凝中动脉皮层支，制备模型，但考虑到中动脉走形多变，该方案具有一定的局限性。Llovera G等[15]采用了中动脉远端三只血管同时电凝，制备dMCAO模型，但制模法对仪器及人员要求高，操作中损伤脑组织和感染的风险增大。本文结合上述方案及本实验室提供小鼠血管实际走形对制模策略进行调整，并考虑到C57BL/6小鼠用途广且对基因相关研究有所帮助的特点[16]，以C57BL/6小鼠采用双电凝一侧大脑中动脉远端同时结扎同侧颈总动脉的策略，制备dMCAO模型，并对模型进行评估。本文提供C57BL/6小鼠大脑中动脉在颞骨区实际走形的图像，并同时指出针对该走形血管实施具体闭塞部位，方便操作者正确识别大脑中动脉，直观指出本次实验闭塞中动脉的具体位置，提高该模型在后续运用的可操作性，旨在完善和推广dMCAO模型。
1.1实验材料 解剖显微镜，显微手术器械，激光微循环血流成像仪(PeriCam PSI，瑞典PERIMED AB公司)，大小鼠转棒仪(ZX-RDM，北京众实迪创科技发展有限责任公司)，大小鼠颅骨钻，电凝笔，2 %TTC，10 %水合氯醛等。
1.2实验方法
1.2.1实验动物 8～10周龄的雄性C57BL/6小鼠，体质量18～24 g，购于内蒙古大学动物研究中心，许可证号SCXK(蒙)2016-0001。饲养于明暗交替室内环境，标准鼠粮喂养，进食水自由。
1.2.2实验分组 54只8～10周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机数字表法分为正常组6只，假手术组6只，dMCAO模型组42只。模型组由于每日制模有限，4组分4 d完成，4组分别为13只、10只、11只、8只，组间同环境生长，组间体质量差异无统计学意义。
1.2.3制备dMCAO小鼠模型 小鼠腹腔注射10 %水合氯醛(0.03～0.035 mL/10g)麻醉，翻正反射(复位反射)消失后，固定消毒小鼠，于颈部正中切口，钝性分离出左侧颈总动脉，并用6～0缝合线永久结扎，缝合。将小鼠右侧卧位固定，消毒，沿耳屏与左眼外眦连线垂直方向切口，钝性分离颞肌上部脱离骨缘，使用颅锥转磨颞骨，暴露大脑中动脉(位置颞骨偏向颅底部)，电凝中动脉，中动脉若无复流，缝合，待小鼠完全苏醒后，放入鼠笼。假手术组只分离右侧颈总动脉，并不结扎，只将颅骨钻孔，暴露大脑中动脉，但并不烧灼此动脉，余步骤同前。正常组不做处理。造模排除标准：制模过程中出血过多或出现蛛网膜下腔出血；
制模时间>30 min；
两次尝试电凝后仍有大脑中动脉皮层支的复流。
1.2.4TTC染色 术后7 d小鼠麻醉取脑，连续切取6个冠状脑片(每片1 mm)，置于2 % TTC中，避光37 ℃孵育20 min。取出脑片置于4 %多聚甲醛避光固定24 h，拍照，用Image-J软件进行图像分析。如果无梗死，梗死体积占比计作0 %；
如果存在梗死，总梗死体积=总梗死面积×脑片的厚度，梗死体积百分比( %)={[总梗死体积-(梗死侧半球体积-梗死对侧半球体积)]/梗死对侧半球体积}×100 %。
1.2.5激光微循环血流成像仪 造模7 d后小鼠取脑做TTC染色前，予激光微循环血流成像仪记录脑血流。麻醉固定消毒小鼠，在顶叶中线处的纵向切口，暴露颅骨。探头在距颅骨表面10 cm处获取图像。使用PimSoft 1.3计算分析两侧半球脑血流。梗死侧脑血流降低百分比(%)=(梗死对侧脑血流平均ROI-梗死侧半球平均ROI)/梗死对侧脑血流平均ROI。
1.2.6转棒实验 各组小鼠于造模前以25 r/min的转速转棒训练3 d，入组标准：在速度为4 r/min 的转棒上，60 s不掉落可入组。各组小鼠分别于造模后3 d和7 d行转棒实验。将小鼠置于转速为25 r/min的转杆上，记录400 s内小鼠在棒时间，若有小鼠超出时间未掉落按照400 s计数，每只小鼠重复3次，两次之间预休息5 min，3次求均值。
2.1C57BL/6小鼠大脑中动脉镜下走形及分布 图1箭头所指的血管即为C57BL/6小鼠大脑中动脉皮层分支经颅骨钻磨骨后在小鼠颅骨颞骨区可见部分。本实验选择的电凝位置即为箭头所指目标血管阶段。见图1。
图1 显微镜下颅骨转磨后中动脉实际走形和电凝位置
2.2dMCAO小鼠模型造模存活率及造模成功率 造模后3 d和7 d，正常组与假手术组3 d和7 d均无小鼠死亡，dMCAO模型组分4组制模，4组小鼠同环境生长，组间小鼠体质量差异无统计学意义，同组均在一天内完成造模，3 d和7 d存活小鼠分别为13/11/10，10/8/8，11/9/9，8/7/6。其3 d和7 d平均存活率分别为83.35 %，78.43 %，本次实验对随机选取(9只)造模7 d小鼠进行麻醉取脑，行TTC染色，排除3 d梗死面积过小的小鼠，不符合后续实验关于梗死体积同质性的要求，计算其造模成功率为66.7 %。
2.3dMCAO模型小鼠出现明显的脑梗死病灶 TTC染色后，正常组脑片呈红色且双侧对称，梗死脑区呈白色。正常组和假手术组脑组织两侧显色对称，未见明显的梗死灶，而dMCAO模型组在右侧近皮质区成白色与对侧同区域相比显色不同，为梗死区域(白色)。软件测量脑片梗死面积，公式计算梗死体积，结果显示正常组和假手术组梗死体积占比0 %，dMCAO模型组(n=6)梗死体积百分比为(18.22±0.89)%，95 %可信区间(17.28,19.15)%。见图2、表1。
表1 三组小鼠梗死体积占比
图2 三组小鼠TTC染色后脑组织情况示意图
2.4dMCAO模型小鼠脑血流明显下降 造模7 d行TTC染色之前，小鼠麻醉，通过激光微循环血流成像仪记录脑血流量，红色区表示正常脑血流成像，黄色绿色区表示缺血区域成像。正常组与假手术组探测两侧脑血流成像均成红色，基本保持对称，dMCAO模型组左侧脑半球呈黄色及绿色，与对侧血供正常区域明显不同。梗死侧脑血流较对侧降低(53.85±1.22)%，95 %可信区间(52.57,55.13)%。见图3。
图3 三组小鼠通过激光微循环血流成像仪显示两侧半球脑血流情况注：A代表各组的两侧脑部血流供应示意图；
B表示各组小鼠实时监测脑血流形成的波形图，ROI即为脑血流量值。C为三组小鼠(6只)操作侧较对侧脑血流降低百分比，与正常组及假手术组比较*P<0.05
2.5dMCAO模型小鼠运动协调能力明显降低 实验小鼠全部符合入组标准，各组6只，分别于造模3 d和7 d后记录在棒时间，dMCAO模型组较假手术组在3 d和7 d在棒时间均明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；
假手术组较正常组在造模3 d和7 d时在棒时间差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。
图4 三组小鼠转棒实验在棒时间情况
1981年Tamura A等[17-18]首次提出大鼠开颅电凝闭塞大脑中动脉制备缺血性脑卒中模型。此后这种经颅中动脉闭塞模型不断完善，远端大脑中动脉闭塞模型就是在此基础上发展起来。
电凝法建立dMCAO模型的难点即为中动脉走形的变异大，电凝位置上选取困难。Majid A等[19]、Kuraoka M等[14]采用单电凝法制备模型，但是实际操作中只能暴露部分中动脉的情况，针对一个存在变异的血管判断走形，尝试闭塞住该段血管，依然有难度；
Llovera G等[15]对大脑中动脉三只血管进行电凝制备模型，梗死24 h体积占比12 %左右，7 d梗死体积占比接近15 %左右，但是孔德莲等[20]同样的策略制备模型，得到结果梗死体积占比32 %左右，数据差异除了小鼠的血管侧支循环存在及小鼠的个体差异，人为的操作因素已经不能被忽视，事实上，小鼠脑体积小，对脑组织过多的电凝，暴露的脑部面积大，对仪器精度及人员要求高，操作的难度增加。本实验采用大脑中动脉双电凝同时结扎同侧颈总动脉方案，梗死体积占比(18.22±0.89) %，与Llovera G等提出梗死体积占比接近，但由于减少了对脑部本身的操作，操作难度减小。人类发生缺血性脑卒中后梗死体积占比绝大多数在5 %～15 %左右[21]，该策略制备模型很接近这一范围，而线栓法制备模型，梗死体积更偏向大面积缺血性脑卒中[15]，大面积缺血性脑卒中仅占缺血性脑卒中的7.6 %[22]。有3只梗死灶面积过小，考虑可能与小鼠侧支循环建立有关。目前评估活体梗死体积，常用核磁、PET-CT及激光微循环血流成像仪等，实验中TTC染色6只可见清晰梗死灶的小鼠激光微循环血流成像仪均可见梗死侧血流明显降低，较对侧血流降低了(53.85±1.22) %。说明激光微循环血流成像仪可以用于评估该模型梗死灶，TTC染色提示梗死体积过小的3只小鼠，梗死侧血流降低百分比在15 %～35 %之间。
本研究在造模过程中，发现如下造模注意事项：(1)钝性分离颈总动脉时切勿损伤迷走神经及颈静脉。(2)造模过程可涂抹眼膏保护小鼠眼睛。(3)小鼠注射麻药根据体质量注意用量。(4)分离颞肌及转磨颅骨时勿伤及颞浅静脉。(5)尽管多数文献提及小鼠颅骨下可见中动脉，但是实际情况可能被骨质内的血管干扰，需转薄颅骨后再确定血管走形。(6)转磨颅骨时需要滴加生理盐水，降低颅骨表面温度。(7)麻醉状态的小鼠注意保温，清醒后小鼠处于过高的温度可能导致后期小鼠死亡。
dMCAO模型针对缺血性脑卒中的研究有着不可替代的优势，但由于中动脉走形变异大，尽管有文献对这段血管闭塞位置进行了大致描述，但我们针对该段血管实际走形了解依然不足，具体情况仍然需要具体的策略。本次实验根据实际血管走形对已有的闭塞策略进行调整，尝试制备dMCAO模型，并通过评估，该方案可以制备相对稳定可靠的dMCAO模型，为实际制备dMCAO模型选取合适闭塞血管提供参照。并对操作中的注意事项进行总结，提高dMCAO模型可操作性，对完善和推广dMCAO模型有所帮助。
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