高良姜素减轻非酒精性脂肪肝大鼠肝脂肪变性和纤维化的机制研究

岑发丽, 李权春,朱丹,何晓莉,毛丽,邱欢,赵婷

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种非酒精、以肝细胞脂肪变性和脂肪过度沉积为主要特征的代谢性肝损伤。随着人们生活水平的提高，NAFLD发病率逐年升高，且呈年轻化趋势[1]。NAFLD与遗传易感、胰岛素抵抗等密切相关，可进一步发展为脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌[2]。肝纤维化是肝脏细胞应对慢性刺激损伤而形成的，是NAFLD渐进性病理改变过程，属可逆病变，积极合理抗纤维化是减轻肝细胞损伤抑制肝硬化的重要措施。目前对NAFLD的治疗多以降糖减脂为主。因此寻找安全有效的治疗NAFLD的药物迫在眉睫。近年来中药在减重减脂和改善脂肪肝方面效果卓越。高良姜素(galangin)是一种黄酮类化合物，主要从高良姜根中提取，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化应激、抗纤维化和抗肿瘤等作用[3]。越来越多的证据表明高良姜素可以改善肝纤维化，如Wang等[4]发现高良姜素通过下调α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和转化生长因子β1(TGF-β1)的表达，减少脂质过氧化，从而减轻四氯化碳介导的大鼠肝纤维化。Xiong等[5]发现在TGF-β1诱导的人肝星状细胞LX-2中，不同浓度的高良姜素通过抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路，抑制LX-2的活化和细胞外基质的合成，通过上调Bcl-2相关X的蛋白质/B细胞淋巴瘤-2(Bcl2-associated X protein/B cell lymphoma-2，Bax/Bcl-2)水平诱导细胞凋亡，从而改善肝纤维化。因此推测高良姜素对NAFLD肝纤维化可能有效，但相关研究目前报道较少。

本研究通过构建NAFLD大鼠和细胞模型，观察高良姜素对NAFLD模型中脂质代谢和纤维化的影响，并进一步阐明其具体的分子机制。以期为NAFLD的治疗提供理论和实验基础。

1.1 材料

1.1.1 实验动物 60只7～8周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量为250～280 g，购自成都华西海圻医药科技有限公司(SYXK(川)2021-238)。饲养于室温23～25 ℃、湿度55%～60%的环境中，光照和黑夜各12 h，饮水饮食正常，分笼饲养，于1周后实验。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.1.2 主要试剂和仪器 LX-2细胞(上海传秋生物科技有限公司)；
胰蛋白酶(美国Invitrogen公司)；
DMEM培养基(美国Gibco公司)；
丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；
茜素红、油红O染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；
HE染色试剂盒、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、p-AMPK抗体(北京博奥森生物科技限公司)；
α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(Collagen-I)(美国Applied Biosystems公司)；
CCK-8试剂盒(上海同仁化学研究所)；
胆固醇调节元件结合蛋白-1C(SREBP-1c)、脂肪酸合酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)引物(苏州金唯智生物科技有限公司)；
高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；
Bio-Rad蛋白电泳仪、转膜仪、凝胶成像系统(美国伯乐公司)；
CO2培养箱(美国Thermo公司)；
倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制作 按随机数字表法将60只大鼠分为对照组(NC组)、高脂组(H组)、高良姜素低剂量组(H+Gal L组)、高良姜素中剂量组(H+Gal M组)和高良姜素高剂量组(H+Gal H组)，每组各12只。NC组大鼠喂以普通饲料，其余各组均喂以高脂饲料(81.5%普通饲料、3%胆固醇、0.5%三号胆盐、5%蛋黄粉、10%猪油)。连续喂养8 w建立NAFLD模型。第9 w开始灌胃给药，H+Gal L组、H+Gal M组、H+Gal H组分别给与25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg 0.9%氯化钠溶液溶解的高良姜素；
NC组、H组灌胃等量的0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续4周。实验过程中大鼠均未死亡。

1.2.2 细胞分组及模型制作 LX-2细胞株接种于含青/链霉素及胎牛血清的DMEM培养基中，并置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。间隔2 d更换一次培养基，待细胞生长至80%密度时，胰酶消化并进行传代。将LX-2细胞分为NC组、H组、H+Gal L组、H+Gal M组和H+Gal H组。除NC组外，其余各组采用0.6 mmol/L油酸处理8 h诱导细胞脂质沉积，NC组加入等量0.9%氯化钠溶液；
随后H+Gal L组、H+Gal M组和H+Gal H组培养基中分别加入25、50、100 μM的高良姜素培养24 h。造模后的细胞随后用于各种实验研究。

1.2.3 大鼠一般情况观察及肝功能指标检测 ①大体观察：造模及给药期间，观察并记录各组大鼠毛色、饮食、活动和精神状况等一般状态；
②体重变化：称取造模前和给药后大鼠体重，计算大鼠体重增加量；
③大鼠肝脏湿重：大鼠处死后，迅速在冰上剥离肝脏，用预冷的0.9%氯化钠溶液洗去血迹，吸掉表面水分，称取肝脏重量；
④血清ALT、AST、TG、TC含量测定：抽取大鼠晨起空腹外周静脉血5 mL，血液静置30 min，4 ℃ 3 000 g离心10 min，分离血清。采用全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、TG、TC水平。

1.2.4 HE染色观察大鼠肝脏组织结构变化 大鼠肝脏用4%多聚甲醛固定，随后包埋石蜡，制作切片(厚度为10 μm)，经过二甲苯浸泡脱蜡、乙醇梯度脱水、苏木精-伊红染色、水中浸泡、乙醇梯度脱水、透明封片，最后于倒置显微镜下观察肝脏细胞结构及排列情况。

1.2.5 油红O染色观察大鼠肝脏组织和LX-2细胞脂肪沉积情况 取出4%多聚甲醛固定的大鼠肝脏和LX-2细胞，油红O溶液染，异丙醇洗涤，苏木精复染，蒸馏水冲洗，中性胶封固，最后于倒置显微镜下观察肝脏组织和LX-2细胞脂肪沉积情况。

1.2.6 Masson染色观察大鼠肝脏组织纤维化情况 固定的石蜡切片经过二甲苯浸泡脱蜡、乙醇梯度脱水、Weigert铁苏木素染色、酸性乙醇分化、Masson返蓝、丽春红品红染色，弱酸工作液清洗、苯胺蓝染色、无水乙醇脱水、透明封片，最后于显微镜下观察肝脏组织纤维化情况。

1.2.7 CCK-8法检测LX-2细胞毒性 取1×103/孔的LX-2细胞接种于96孔板，37 ℃下孵育过夜。细胞在含0.6 mmol/L油酸的DMEM培养基中处理8 h诱导细胞脂质沉积，随后加入25、50、100、150、200 μM的高良姜素孵育24 h。将培养基换成含有10% CCK-8溶液的新鲜DMEM培养基。将细胞在37 ℃下孵育1 h。使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

1.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡水平 取5×105个细胞离心，用PBS洗涤、Binding Buffer悬浮细胞。再各加入10 μL AnnexinV-FITC和PI，避光孵育30 min，最后用流式细胞仪检测细胞凋亡。以NovoExpressTM软件进行分析。

1.2.9 LX-2细胞TG、TC含量检测 LX-2细胞接种于96孔板，并置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。间隔2 d更换一次培养基，待细胞生长至80%密度时，胰酶消化，PBS洗涤并收集细胞，按照试剂盒说明书检测细胞中TG、TC含量。

1.2.10 RT-qPCR检测肝脏组织和LX-2细胞脂质合成相关基因的表达 采用Trizol试剂从肝脏组织和LX-2细胞中提取总RNA。使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，并使用SYBR Green法进行扩增，GAPDH作内参。反应条件：95 ℃预变性30 s，94 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，共40个循环。使用2-ΔΔCT公式计算SREBP-1c、FASN、ACC mRNA的相对表达水平。PCR引物序列：SREBP-1c-F：5′-GCAGCAACGGGACCATTCT-3′，SREBP-1c-R：5′-CCCCATGACTAAGTCCTTCAACT-3′。FAS-F：5′-GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT-3′，FAS-R：5′-TGGGT-AATCCATAGAGCCCAG-3′。ACC-F：5′-CTCCCGATTCATAA-TTGGGTCTG-3′，ACC-R：5′-TCGACCTTGTTTTACTAGGTGC-3′。GAPDH-F：5′-GGTGAAGGTCGGAGTGAACG-3′，GAPDH-R：5′-CGTGGGTGGAATCATACTGGA-3′。

1.2.11 Western-blot检测肝脏组织和LX-2细胞纤维化相关蛋白、AMPK蛋白表达 取各组大鼠肝脏组织和LX-2细胞，加入RIPA组织裂解液裂解并提取蛋白，使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，利用蛋白缓冲液稀释蛋白，进行凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，电泳后将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，放入含脱脂牛奶的TBST中4 ℃封闭2 h，分别加入Collagen-I、α-SMA、p-AMPK、AMPK一抗(1 ∶2 000)4 ℃过夜。经TBST洗涤后，加入二抗(1 ∶10 000)4 ℃孵育2 h，加入ECL显色剂显色，使用Bio-Rad凝胶成像仪拍照，分析各组蛋白相对GADPH的表达量。

1.3 统计学方法

2.1 高良姜素减轻NAFLD大鼠肝脂肪变性和纤维化

2.1.1 各组大鼠一般情况 NC组大鼠毛色顺滑有光泽，精神良好，较活跃，体重稳定增加；
给与高脂喂养后，H组大鼠毛色暗淡无光泽，精神萎靡、嗜睡，不活跃，体重快速增加；
给与不同浓度高良姜素灌胃后，H+Gal L组、H+Gal M组、H+Gal H组大鼠大鼠情况有所改善，毛色逐渐润泽，精神较好，活跃程度增加，体重缓慢增加，且呈高良姜素剂量依赖性。

2.1.2 各组大鼠肝湿质量及肝功能指标检测 与NC组相比，H组大鼠肝湿质量、TG、TC、AST、ALT水平明显升高(P<0.05)；
与H组相比，H+Gal L组、H+Gal M组、H+Gal H组肝湿质量、TG、TC、AST、ALT水平明显降低(P<0.05)。说明高良姜素能够改善NAFLD大鼠血脂水平，且呈高良姜素剂量依赖性。见图1。

2.1.3 各组大鼠肝脏组织病理学检测 HE染色结果显示，NC组大鼠肝细胞排列紧密，大小均匀，细胞核清晰，未见脂肪变性细胞；
H组肝细胞发生脂肪变性，细胞肿大变圆，内含较大的脂肪滴，呈现典型的空泡样改变，部分细胞核挤向胞膜边缘；
H+Gal L组、H+Gal M组、H+Gal H组肝细胞脂肪变性明显改善，脂滴数量减少，仅存在少量小泡样脂肪变。

图1 各组大鼠肝湿质量及肝功能指标检测 A: 肝湿质量; B: TG水平; C: TC水平; D: AST水平; E: ALT水平; 与NC组相比, *P<0.05; 与H组相比, #P<0.05

油红O染色结果显示，NC组大鼠几乎未见脂滴；
H组肝细胞内红染，脂滴呈片状堆积，脂滴明显增大，部分细胞核挤向胞膜边缘；
H+Gal L组、H+Gal M组、H+Gal H组肝细胞脂肪变明显改善，仅有少量脂滴弥漫性分布，稀疏散在，脂滴体积较小。说明高良姜素能够改善NAFLD大鼠脂肪变性，且呈高良姜素剂量依赖性。见图2。

图2 各组大鼠肝脏组织病理学检测(×200)

2.1.4 各组大鼠肝脏组织纤维化检测 Masson三色染色结果显示，NC组肝小叶结构完整，未见蓝色胶原沉积；
H组存在大小不等的纤维间隔，可见大量蓝色胶原沉积，纤维化程度明显；
H+Gal L组、H+Gal M组、H+Gal H组纤维化程度明显改善，可见肝小叶中心性窦周纤维化和门静脉周围纤维化，存在少量胶原沉积。说明高良姜素能够改善NAFLD大鼠肝纤维化，且呈高良姜素剂量依赖性。见图3。

2.1.5 各组大鼠肝脏组织脂质合成相关基因及纤维化相关蛋白、AMPK蛋白检测 RT-qPCR和Western bolt结果显示，与NC组相比，H组大鼠SREBP-1c、FAS、ACC mRNA水平，Collagen-I、α-SMA蛋白水平明显升高，p-AMPK/AMPK蛋白水平明显降低(P<0.05)；
与H组相比，H+Gal L组、H+Gal M组、H+Gal H组SREBP-1c、FAS、ACC mRNA水平，Collagen-I、α-SMA蛋白水平明显降低，p-AMPK/AMPK蛋白水平明显升高(P<0.05)。说明高良姜素能够抑制NAFLD大鼠脂质合成相关基因及纤维化相关蛋白的表达，激活AMPK信号通路，且呈高良姜素剂量依赖性。见图4。

2.2 高良姜素减轻NAFLD细胞脂肪变性和纤维化

2.2.1 不同浓度高良姜素对LX-2细胞活力的影响 CCK-8实验显示，当高良姜素浓度在25～100 μM范围时，对细胞活力没有显著影响(P>0.05)；
当浓度>150 μM时，显著降低细胞存活率(P<0.05)(图3)。因此当高良姜素浓度小于100 μM时不会造成细胞毒性。

图3 各组大鼠肝脏组织纤维化检测(×200)

图4 各组大鼠肝脏组织脂质合成相关基因及纤维化相关蛋白、AMPK蛋白检测 A: SREBP-1c、FAS、ACC mRNA水平; B: Collagen-I、α-SMA、AMPK、p-AMPK蛋白水平; 与NC组相比, *P<0.05; 与H组相比, #P<0.05

图5 不同浓度高良姜素对LX-2细胞活力的影响 与0 μM高良姜素组相比, *P<0.05

2.2.2 各组细胞凋亡水平检测 AnnexinV-FITC/PI双染结果显示，与NC组相比，H组细胞凋亡水平明显升高(P<0.05)；
与H组相比，H+Gal L组、H+Gal M组、H+Gal H组细胞凋亡水平明显降低(P<0.05)。说明高良姜素能够改善LX-2细胞凋亡水平，且呈高良姜素剂量依赖性。见图6。

2.2.3 各组细胞TG、TC含量检测 与NC组相比，H组细胞TG、TC水平明显升高(P<0.05)；
与H组相比，H+Gal L组、H+Gal M组、H+Gal H组细胞TG、TC水平明显降低(P<0.05)。说明高良姜素能够改善LX-2细胞脂质水平，且呈高良姜素剂量依赖性。见图7。

2.2.4 各组细胞脂质沉积检测 油红O染色结果显示，NC组基本无橘红色脂滴；
H组可见大量橘红色脂滴，且具有脂滴融合现象，脂肪变性程度较重；
H+Gal L组、H+Gal M组、H+Gal H组可见少量橘红色脂滴，较少脂滴融合，脂肪变性程度较轻。说明高良姜素能够改善LX-2细胞脂质沉积，且呈高良姜素剂量依赖性。见图8。

图6 各组细胞凋亡水平检测 与NC组相比, *P<0.05; 与H组相比, #P<0.05

图7 各组细胞TG、TC含量检测 A: TG含量; B: TC含量; 与NC组相比, *P<0.05; 与H组相比, #P<0.05

2.2.5 各组细胞脂质合成相关基因及纤维化相关蛋白、AMPK蛋白检测 RT-qPCR和Western bolt结果显示，与NC组相比，H组细胞SREBP-1c、FAS、ACC mRNA水平，Collagen-I、α-SMA蛋白水平明显升高，p-AMPK/AMPK蛋白水平明显降低(P<0.05)；
与H组相比，H+Gal L组、H+Gal M组、H+Gal H组SREBP-1c、FAS、ACC mRNA水平，Collagen-I、α-SMA蛋白水平明显降低，p-AMPK/AMPK蛋白水平明显升高(P<0.05)。说明高良姜素能够抑制LX-2细胞脂质合成相关基因及纤维化相关蛋白的表达，激活AMPK信号通路，且呈高良姜素剂量依赖性。见图9。

2.3 高良姜素减轻NAFLD大鼠肝脂肪变性和纤维化的可能机制

我们利用高脂饲料(油酸)构建了NAFLD大鼠(细胞)模型，通过灌胃不同浓度的高良姜素，观察其对大鼠肝脏组织结构、脂质代谢、纤维化及AMPK信号通路的影响，分析高良姜素治疗NAFLD大鼠肝脂肪变性和纤维化的可能机制。我们发现高良姜素对肝细胞无毒副作用，能够抑制肝细胞凋亡。高良姜素通过降低TG、TC、AST、ALT水平改善肝功能；
通过降低SREBP-1c、FAS、ACC mRNA水平抑制脂质合成；
通过降低Collagen-I、α-SMA蛋白水平抑制纤维化水平；
同时AMPK信号通路相关蛋白表达减少，且呈高良姜素剂量依赖性。由此我们推断高良姜素通过激活AMPK信号通路改善NAFLD大鼠肝脂肪变性和纤维化。见图10。

图8 各组细胞脂质沉积检测(×200)

图10 高良姜素减轻NAFLD大鼠肝脂肪变性和纤维化的可能机制

NAFLD是一个疾病谱，开始为单纯性肝细胞脂肪变性，随后可进展为非酒精性脂肪性肝炎，最后转化为肝硬化，甚至肝癌等[6]。其发病机制尚未完全阐明，目前被广泛接受的是二次打击假说。肝内TG大量沉积引起的脂肪变性为“一次打击”，随后脂肪变性经氧化应急、炎症反应刺激发展为脂肪性肝炎、肝纤维化为“二次打击”[7]。因此减少肝细胞脂肪变性和纤维化是治疗NAFLD的关键。高良姜素主要存在于高良姜根中，是一种黄酮类化合物，具有保护皮肤、抗糖尿病、抗纤维化及抗肿瘤等药理作用[8]。研究报道高良姜素能够治疗多种肝脏疾病[9]。Li等[10]发现高良姜素通过抑制BRL细胞凋亡，减轻体内外肝脏缺血再灌注损伤。Salama等[11]发现高良姜素通过下调炎症因子TNF-α、IL-1β水平，降低肝脏铁含量和血清铁蛋白水平，缓解铁超载诱导的肝损伤。另外高良姜素也通过抑制细胞增殖、转移及血管生成，诱导细胞凋亡和自噬，从而抵抗肝细胞癌[12]。本研究通过构建NAFLD大鼠和细胞模型，首次探究了高良姜素对NAFLD脂肪变性和纤维化的可能机制。发现高良姜素通过激活AMPK信号通路改善NAFLD大鼠肝脂肪变性和纤维化，且呈剂量依赖性。

脂肪变性是NAFLD“一次打击”。脂质合成在内质网中进行，而肝细胞存在大量内质网。SREBP-1c为内质网跨膜蛋白，是脂质合成过程中的重要转录因子，过表达SREBP-1c可引起肝细胞脂肪变性[13]。FAS和ACC是SREBP-1c下游作用靶点，是参与脂质代谢的关键酶，在脂肪酸及甘油三酯合成中起重要作用[14]。Nguyen等[15]发现SREBP-1c基因沉默能够抑制肝脏脂质合成，且SREBP-1c与NAFLD发病直接相关。Fang等[16]研究提示干扰SREBP-1c表达，可降低LO2肝细胞FASN和ACC蛋白水平，减轻细胞内脂质积累。本研究发现高良姜素能够降低SREBP-1c、FAS和ACC mRNA的水平；
同样检测了肝细胞脂质沉积情况，HE和油红O染色发现在高良姜素作用下，肝细胞内脂滴明显减少，与TG、TC含量减少结果一致。说明高良姜素能够抑制NAFLD大鼠脂肪变性。

肝纤维化是NAFLD“二次打击”。肝纤维化是NAFLD进展的中间阶段，随着肝纤维化进展，NAFLD可发展为肝硬化甚至肝癌。肝纤维化能够预测肝脏不良结局，对于评估NAFLD患者预后十分重要[17]。研究表明肝脏纤维化会损害肝细胞结构和功能，进而引起血脂、血糖异常。Collagen-I、α-SMA蛋白是纤维化标志物。贺微微等[18]发现人参皂苷Rg1通过降低Collagen-I、α-SMA水平改善高脂饮食诱导的NAFLD肝纤维化。本研究中高良姜素能够降低Collagen-I、α-SMA蛋白水平；
同时Massan染色发现在高良姜素作用下，肝组织内胶原沉积减少。说明高良姜素能够抑制NAFLD大鼠肝纤维化。

AMPK广泛分布于全身各种脏器，如心、脑、肝、肺、肾等[19]。AMPK信号通路是脂代谢的关键激酶。活化的AMPK能够抑制ACC的活性，从而抑制TG、TC及脂肪的合成，从而降低脂肪肝的发生[20]。如Chyau等[21]发现安曲丹通过激活AMPK/SREBP-1c通路，能够有效抑制血浆TG、TC水平，从而改善NAFLD小鼠脂肪肝。Chyau等[22]发现NAFLD随着硒蛋白P水平升高而加重，硒蛋白P通过抑制AMPK/ACC积累TG。同样AMPK信号通路在肝纤维化中也发挥重要作用。如Pan等[23]发现在四氯化碳小鼠模型中，AMPK通过抑制TGF-β1和α-SMA的表达并抑制人造血干细胞的增殖，且呈剂量和时间依赖性方式。JO等[24]发现高脂饮食喂养的C57BL/6J小鼠模型中，丁香酚通过激活AMPK通路，减少Collagen-I、α-SMA的表达，改善脂肪酸相关的肝纤维化。本研究中高良姜素能够提高p-AMPK/AMPK水平，说明高良姜素对NAFLD大鼠肝损伤的修复可能与AMPK信号通路有关。

综上所述，高良姜素能够减轻NAFLD大鼠肝脂肪变性和纤维化，促进大鼠肝功能恢复，其可能通过激活AMPK信号通路发挥作用。

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