三种方法测定合成鱼腥草素片含量的结果比较
时间：2023-02-27 12:00:05 来源：千叶帆 本文已影响人
张 雁，刘长荣，梅 慧，邓映明（通信作者）
（梅州市食品药品监督检验所化学室 广东 梅州 514071）
合成鱼腥草素是鱼腥草素的亚硫酸氢钠加成物，具有抗菌[1-3]、抗炎及免疫调节[4-9]等药理作用，临床应用广泛，常与抗生素联用治疗上呼吸道感染，慢性支气管炎，肺炎等。市场上存在鱼腥草素钠与合成鱼腥草素两种制剂，但两者均为化学合成产物，合成工艺相同，李雪等[10]研究证实，合成鱼腥草素与鱼腥草素钠实为同一物质，应统一质量标准。现行的合成鱼腥草素片的标准为部颁标准WS1-34（B）-89，多年来未进行标准提高，较为滞后，其中含量测定采用碘量法进行滴定，在实际操作过程中发现碘量法易受辅料和不同厂家来源淀粉指示剂等多种因素干扰[11-12]，滴定终点蓝紫色的颜色判断，不同操作人员存在较大差异，数值判定因人而异，方法专属性较差；
现有文献报道，合成鱼腥草素含量测定方法除碘量法外还有电位滴定法、高效液相色谱法及毛细管带电泳法等[13-15]。本文旨在比较高效液相色谱法、电位滴定法及碘量法在合成鱼腥草素片含量测定上的差异，以期为建立质量标准提供参考。
高效液相色谱仪LC-20ADXR（日本岛津公司），全自动电位滴定仪梅特勒G20 s（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），梅特勒电子分析天平（XSR205DU/A，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。鱼腥草素钠对照品（批号：100247-202102，含量99.4%，中国食品药品检定研究院），合成鱼腥草素片（厂家A：批号为202104501、202104502、202106501、202106502、202106503；
厂 家B：
批 号 为20210815、20211001、20211005）。碘滴定液（0.1 moL/L）（深圳市博林达科技有限公司，批号：20220701A1），甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2.1 高效液相色谱法
（1）溶液的制备。①对照品溶液：精密称取鱼腥草素钠对照品25 mg，置50 mL 量瓶中，流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液，取上述溶液依次稀释成含合成鱼腥草素约0.5、2.0、5.0、10.0、25、50 μg/mL 的系列标准溶液。②供试品溶液：取合成鱼腥草素片10 片，除去糖衣，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于鱼腥草素钠25 mg），置50 mL 量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置50 mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。（2）高效液相色谱法色谱条件。色谱柱：phenomenex Luna C8（150×4.60 mm 5 μm）；
流动相：甲醇-水-10%四丁基氢氧化铵溶液（55 ∶45 ∶0.3）；
流速：1 mL·min-1，检测波长286 nm；
柱温45 ℃；
进样体积20 μL。
2.2 碘量法
取合成鱼腥草素片10片，置碘瓶中，加氢氧化钠液（0.2 moL/L）100 mL，振摇使合成鱼腥草素溶解完全后，移入冰浴中冷却，加4 ℃以下的硫酸液（0.5 moL/L）40 mL，与淀粉指示液2 mL，立即用碘液（0.1 moL/L）快速滴定至显蓝色，每1 mL 碘液（0.1 moL/L）相当于15.12 m g的C12H23NaO5S。
2.3 电位滴定法
照“2.2”同法制备供试品溶液，浸入铂-饱和甘汞电极，按电位滴定法，立即用碘滴定液（0.1 moL/L）迅速滴定。记录消耗滴定液的体积与电位值，以电位e 为纵坐标，以滴定液体积v 为横坐标，绘制e-v 曲线，曲线拐点处即为滴定终点。
2.4 方法学考察结果
2.4.1 线性关系考察 精密量取“2.1.1”项下系列标准溶液，照“2.1.2”项下色谱条件测定。以质量浓度为横坐标（X），峰面积值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。合成鱼腥草素在其线性范围（0.50 ～50 μg/mL）内的回归方程为y = 110.16x-6.6494（r= 1.000），表明其线性关系良好，色谱图见图1。
图1 高效液相色谱法色谱图
2.4.2 精密度试验 取“2.1.1”项下对照品溶液，连续进样6 次，每次20 μL，记录结果。测得鱼腥草素钠峰面积RSD 为0.37%，表明仪器精密度良好。
2 . 4 . 3稳定性试验：
称取样品6 份（批号为202104501），室温下分别于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.2”项色谱条件下进行测定，测得合成鱼腥草素峰面积的RSD 为0.58%，表明该供试品溶液在24 h 内稳定性良好。
2.4.4回收率试验：取已知含量的样品（批号为202104502）适量（约相当于合成鱼腥草素0.15 g，相当于5 片）加入原料药0.12、0.15、0.18 g（相当于80%、100%和120%，因用量较大，用已知含量原料药代替对照品），加入辅料，置具塞锥形瓶中，照3 种测定项下方法制备回收率样品，依法测定，高、中、低3 种质量浓度的回收样品（n= 3），求得加样回收率，见表1。
表1 回收率试验结果
2.5 3 种方法结果比较
分别采用高效液相色谱法、电位滴定法以及碘量法对合成鱼腥草素片的含量进行测定，结果显示，对于同一批样品，高效液相色谱法与电位滴定法相当，而碘量法的测定结果较上述两种方法测定结果高，见表2。
表2 3 种方法含量测定结果（%）
原料药测定结果。3 种方法测定原料药结果一致，测定结果与厂家提供的原料药含量一致。说明3 种方法在没有其他因素的干扰下均能对合成鱼腥草素进行准确定量。
辅料对结果的干扰。3 种方法测定结果表明，碘量法测定时含量最高，电位滴定法最低，高效液相色谱法的回收率较其他两种方法高，更为准确。碘量法与电位滴定法原理一样，为碘分子与合成鱼腥草素中的亚硫酸根进行氧化还原反应，终点颜色由浅黄色至蓝褐色的渐变过程；
单独对辅料进行空白滴定，需消耗2 ～3 滴的碘滴定液，这可能是碘量法测定结果较高的原因之一，电位滴定法溶液的颜色为黄棕色时曲线出现拐点，并未到达蓝褐色，是造成结果数值较低的主要因素。辅料中的糊精也是对结果的判定不一致的重要因素，原料药溶液澄清，终点为明显的蓝色，容易判断，而辅料的加入使得溶液颜色变浑浊，由原来的澄清变成乳白状悬浮液，滴定至接近终点时溶液颜色从黄色变成红棕色，难以观察到蓝色变化，很容易造成干扰，导致终点的误判；
高效液相色谱法经过色谱柱的分离，可以很好地避免辅料的影响，测定结果可信度更高。
可溶性淀粉的选择。淀粉可分为支链淀粉和直链淀粉，支链淀粉遇碘呈红紫色，直链淀粉遇碘呈蓝色，生成蓝色配合物，此反应是特征反应，灵敏度高。故而不同厂家的可溶性淀粉他的指示效果各不相同，对终点颜色的判断也不同，需要注意选择。
综上所述，通过高效液相色谱法、碘量法与电位滴定法三种测定方法进行比较，结果表明高效液相色谱法在有辅料干扰的情况下，更适合对合成鱼腥素片含量进行测定，但碘量法与电位滴定法无需对照品，其对样品的处理操作也比较简单。现行的合成鱼腥草素片质量标准应该进一步完善。
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