3D打印仿生支架在脊髓损伤修复中的研究进展

张浩 张钰 肖世宁 刘家明

1南昌大学第一附属医院骨科（南昌 330006）；
2南昌大学第四临床医学院（南昌 330100）；
3南昌大学脊柱脊髓研究所（南昌 330006）

3D打印技术起源于20世纪90年代，是一种增材制造（AM）技术，借助计算机辅助设计和计算机辅助制造（CAD/CAM）工具来控制打印物的宏观形状和每一分层的细微结构，并结合材料科学和机械制造等技术来选择打印原材料和设定打印程序［1-2］。该技术具有高度的自由化，不需要特定的工业模具以及繁杂的工艺，只需要选择原材料并设计好3D打印机需执行的数据模型，就能打印出所设计的三维结构。随着技术的不断成熟和完善，3D打印技术目前已被广泛应用于汽车、航空和医疗等领域［3］。

在医疗领域中，灵活便捷的3D打印技术已经在生成骨骼、肌肉等生物结构和人工关节假体等植入式医疗器械方面取得了成功，该技术既能保证精准度，又能使物质快速成型，同时保持良好的生物相容性，促进包括脊柱外科治疗在内的许多临床治疗开发出了简便、高效的新型方案，并在实际应用中取得了良好的成效［4-5］。3D打印技术也为当前难以解决的脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）问题提供了新的思路与方向，利用3D打印技术可以打印出具有精细孔隙结构的仿生脊髓支架填补SCI在损伤部位产生的间隙，通过改善微环境来促进轴突修复和再生，同时可以搭载相应的干细胞来促进细胞分化并减少炎症反应［6］。

目前多种3D打印生物支架已被研发，包括传统材料支架、新型材料支架和承载细胞的支架等，并通过动物SCI模型进行了实验研究，验证了3D打印仿生脊髓支架的对SCI修复的促进作用。本文就近期3D打印仿生脊髓支架的实验研究进展进行综述，探究3D打印技术制造的脊髓支架对SCI修复的效果，为临床上应用3D打印技术解决SCI修复问题提供理论依据和研究方向。

SCI是指由压迫、碰撞和撕裂等外界物理因素造成的原发性损伤，以及损伤后的炎症反应和血栓形成导致的继发性损伤。SCI会引起损伤区域的微环境改变，包括瘢痕组织形成、营养因子缺乏和髓鞘蛋白中神经再生抑制因子的表达，这些改变均不利于神经组织的再生修复［7］，如果没有有效的治疗措施介入，SCI后的自我修复将十分困难。目前，治疗SCI的主要方法是外科手术减压和物理固定损伤脊柱，并借助药物辅助治疗［8］，但治疗效果往往不够理想。因此，SCI的科学治疗仍是当前研究的热点问题。3D打印技术可以精准制造出复杂的三维脊髓支架和所需的修复细胞，在SCI动物实验中取得了理想的效果，为临床SCI的治疗提供了新的思路。

3D生物打印是以生物材料、活性物质与活细胞等作为生物墨水，通过建模软件设定打印程序后，利用特殊的打印装置形成具有三维立体结构的类组织体，其过程可分为4个步骤：数据采集、材料选择、生物打印和功能化［9］。在现有的3D打印技术中，喷墨打印、微挤压打印、立体光刻和熔融沉积建模等方法在神经组织工程领域的应用越来越受关注。

生物支架是当前治疗SCI的热点方向。3D打印脊髓支架利用胶原蛋白等生物分子材料，并通过扫描脊髓损伤处的结构设计出特异性的脊髓支架模型，从而得到具有满足植入要求的形状大小以及完整内部结构的脊髓支架，并且在植入脊髓损伤处时可以判断方位，精准地与脊髓损伤端相结合［10-11］，有利于损伤区域的修复再生。轴突再生和损伤区域的重新连接是SCI修复的前提，并且继发性损伤期是治疗的关键时期［12］。3D打印脊髓仿生支架既可以作为损伤区轴突再生的接触引导，也可以作为传递干细胞的载体，从而改变不利于神经再生的微环境［6］。因此，3D打印仿生支架对于继发性损伤的治疗十分有效，在整体的SCI治疗方面具有先天的优势。

当前用于3D打印脊髓支架的原料主要是胶原蛋白，这种材料具有良好的生物相容性，但也有稳定性差等局限性。研究者通过用其他材料与胶原蛋白混合作为3D打印的原料，利用各材料的优势互补制作出了具有理想效果的仿生脊髓支架。随着技术的不断发展，越来越多的新型材料被用来作为3D打印脊髓支架的原材料，并在特定情况下结合神经干细胞、特殊的细胞因子等提高支架的应用效果。

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，具有低免疫原性和良好的生物相容性，但是热稳定性、力学性能和抗酶性较差。虽然在组织工程中运用较多，但其应用仍受自身性质的约束［13］。将胶原蛋白与其他互补的生物材料相结合，可以得到适合制作脊髓支架的混合材料，很好地改善了传统支架在应用中遇到的问题。目前对于3D打印制造的改良胶原蛋白支架均在动物实验中验证了支架对于SCI修复的促进作用，可以加速SCI后的神经系统重建和神经功能恢复。

2.1 3D打印胶原蛋白/壳聚糖仿生脊髓支架 史新宇等［11］设计将壳聚糖与胶原蛋白结合来弥补胶原蛋白机械性能弱的缺点，利用3D打印技术制造出了胶原蛋白/壳聚糖仿生脊髓支架，并通过实验观察该支架对脊髓损伤大鼠的治疗作用。结果3D打印胶原/壳聚糖支架组大鼠的BBB评分和斜坡实验角度均高于其他组，并且运动诱发电位和体感诱发电位相比于其他组潜伏期更短、振幅更大，表面运动功能恢复效果优于其他组。MRI和弥散张量成像结果也显示该组大鼠的神经功能恢复良好。朱旭［14］也利用3D打印胶原/壳聚糖支架探索其对脊髓损伤大鼠的治疗效果，通过对大鼠的BBB评分和斜板爬壁实验以及在离体后采用HE染色、Bielschowsky银染和NF免疫荧光染色方法检测对比后发现，各项结果均表明3D打印支架组的大鼠神经组织恢复效果明显优于其他组。可见，壳聚糖与胶原蛋白结合具有互补的作用，以二者为原材料利用3D打印技术制造的仿生脊髓支架具有良好的生物相容性和力学性能，对于SCI的修复有明显的促进作用。

近年来，随着组织工程学的发展，生物支架、种子细胞、神经因子三者联合移植被认为是目前治疗SCI的有效疗法［15］。生物支架搭载特定神经因子修饰种子细胞，既可以根据特定的损伤情况进行细胞修饰，又能保障种子细胞有适宜的生理环境发挥修复作用。神经干细胞（NSCs）具有强大的增殖能力和分化多向性，在神经治疗方面有着巨大的潜力，经神经因子修饰的NSCs直接注射至病变处对SCI的修复具有正向促进作用［16］。生物支架可以为细胞提供所需的理想生理环境，促进NSCs在SCI修复中的分化进程，因此将支架与修饰后的细胞结合是当前的研究热点［17］。LIU等［18］通过低温3D打印制造了一种脑源性神经营养因子（BDNF）集成的胶原蛋白/壳聚糖支架，可以延长BDNF在SCI治疗中的释放，在植入SCI大鼠体内后促进了神经纤维再生和突触连接的建立，增强了损伤部位的髓鞘再生。隋曌等［19］等制备了吸附神经营养素-3（NT-3）的3D打印胶原蛋白/壳聚糖支架，用于SCI大鼠实验中发现植入该支架的SCI大鼠在BBB评分、斜坡爬壁实验和神经纤维再生数量等各项指标中均优于对照组，表明该支架对SCI的修复具有良好的促进作用。刘晓云［20］开发了一种由功能性壳聚糖，透明质酸衍生物和基质胶组成的新型生物相容性生物墨水，这种材料打印的支架可以保持高NSC活力（约95%），并提供良性的微环境，促进细胞-物质相互作用和神经元分化，以优化神经网络的形成。并且通过大鼠体内实验证明了该支架可以促进轴突再生，减少神经胶质瘢痕沉积，使大鼠的运动功能恢复显著。

值得注意的是，除了利用MRI、电生理评分等传统方法来检测SCI修复的效果外，FRIEDRICH等［21］利用3D打印技术制造了一种模块化微流控稳态成像板，并证实了该装置可以在离散时间段内观察损伤脊髓的再生过程，这项技术在以后的SCI修复实验中具有很好的应用前景。

2.2 3D打印胶原蛋白/硫酸肝素仿生脊髓支架

与壳聚糖的作用相似，硫酸肝素与胶原蛋白结合可以弥补胶原蛋白力学性能的不足，并延长降解时间［22］。JIANG等［23］的研究证实，3D打印胶原蛋白/硫酸肝素支架具有良好的力学性能和生物相容性，并且降解速率较慢。张仁坤等［24］借助3D打印机将胶原蛋白和硫酸肝素的结合物制备出了一种具有规律孔隙的高度仿生神经组织的新型支架材料，将其作为3D打印仿生脊髓支架的原材料具有很好的应用前景。CHEN等［25］观察3D打印胶原蛋白/硫酸肝素仿生脊髓支架对脊髓损伤大鼠的治疗作用，发现3D打印支架组大鼠的运动功能明显恢复，并通过电生理检查发现支架组的神经丝（NF）大量增多，进一步改善了SCI的病理损伤。张仁坤等［26］将3D打印胶原蛋白/硫酸肝素仿生脊髓支架载NeuroD1修饰的NCSs用于大鼠脊髓损伤的修复，结果显示支架+NSCs-NeuroD1组的Tarlov和Rivlin评分和各时间段BBB评分均高于其他对照组，并在所有实验组中运动和感觉潜伏期最短、振幅最大，表明该治疗方法可以促进脊髓损伤大鼠的神经修复。

用于SCI修复的NCSs可来源于诱导多能干细胞（iPSCs）［27］，iPSCs是一种由哺乳动物成体细胞经转入转录因子等手段脱分化形成的多功能干细胞，与胚胎干细胞拥有相似的再生能力，可以用来替代一些难以获得的干细胞进行研究和治疗，并且在实际应用中的伦理争议很小，诱导iPSCs进行定向分化是再生医学的热点研究方向。李长明等［15］利用尿液中的肾小管细胞诱导出了iPSCs，并使其分化为NCSs。之后利用3D打印胶原蛋白/硫酸肝素仿生脊髓支架载iPSCs来源的NSCs进行急性脊髓损伤大鼠的修复，结果显示iPSCs-NSCs组术后2～8周的BBB评分、神经电生理检测结果以及术后8周的Tarlov、Rivlin评分均高于模型组和支架模型组。表明3D支架载尿液细胞来源iPSCs-NSCs移植对急性脊髓损伤大鼠的修复具有良好的促进作用。

2.3 3D打印胶原蛋白/丝素蛋白仿生脊髓支架

丝素蛋白是从蚕丝中提取的一种具有良好的力学性能、生物相容性以及低免疫原性的天然生物材料［28］，可与胶原蛋白进行互补共同作为脊髓仿生支架的材料。刘晓银等［29］为检验弥散张量成像与运动功能之间的相关性，利用3D打印胶原蛋白/丝素蛋白仿生脊髓支架对脊髓损伤大鼠进行实验，并通过BBB评分、斜坡爬壁实验来检验大鼠神经功能恢复的效果。结果显示，3D打印胶原蛋白/丝素蛋白支架更能促进损伤大鼠运动功能的恢复。JIANG等［30］将3D打印胶原蛋白/丝素蛋白支架与NCSs相结合用于大鼠脊髓损伤的修复，发现该组大鼠的BBB评分、斜坡爬壁实验的坡度均高于其他组，并且该组大鼠的脊髓损伤空隙内的填充组织较多，说明支架可促进神经组织的再生修复。LI等［31］利用3D打印技术制造的胶原蛋白/丝素蛋白支架（3D-C/SF）模拟皮质脊髓束，将其与冷冻干燥技术制备的支架（C/SF）分别植入SCI大鼠中进行对比，结果3D-C/SF组在组织学分析中表现出较少的病变和无序结构，并且在病变部位表现出更多的GAP43阳性特征。在单纯使用胶原蛋白/丝素蛋白仿生脊髓支架的基础上，CHEN等［32］将人脐间充质干细胞吸附在支架上共同植入SCI大鼠中观察疗效，通过BBB评分、斜坡爬壁实验和MRI等指标与对照组相比，结果均提示这种搭载间充质干细胞的新型支架可以促进神经纤维和髓鞘再生，加速损伤部位的突触连接。

3.1 3D打印甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）支架

聚乙二醇（二醇）二丙烯酸酯（PEGDA）是一种亲水、有弹性的空白板岩水凝胶，可用于制造各种生物分子。3D打印PEGDA-GelMA支架可改变星形胶质细胞的反应性，使星形胶质细胞的足突平行于支架通道内的再生轴突，并可促进生长，降低损伤区域的炎症反应［33］。KOFFLER 等［34］使用微尺度连续投影打印（μCPP）的方法制备了3D仿生PEGDA-GelMa支架，用于脊髓损伤再生的研究，支架内具有精确的CNS结构。在实验中，3D仿生PEGDA-GelMa支架表现出了良好的生物相容性，并且在4周后仍未发生断裂或变形，与其他组的生物支架相比具有良好的力学性能。在另一项研究中，ZHU等［35］通过基于立体刻印的生物打印技术制备了PEGDA-GelMa支架，并将NCSs移植到支架上，之后将低水平光疗法（LLLT）与该支架进行结合使用，探索细胞后续的增殖和分化。实验结果显示，胶质细胞标记物的表达受到抑制，阳性神经元细胞大量增多，激光刺激细胞中神经元makers基因表达水平上调。表明LLLT与PEGDAGelMa支架相结合对神经组织修复具有显著的促进作用。

HAMID等［36］利用聚己内酯（PCL）与GelMa结合打印仿生脊髓支架，相比于传统制造方法，3D打印可以明显提高该支架的孔隙率。将拟胚体（EB）加入到支架中进行诱导分化实验，结果显示分化的EBs中含有βⅢ-微管蛋白阳性神经元，并表现为轴突延伸和细胞迁移，这表明该支架可促进EBs的神经分化，可推动SCI的修复。王键豪等［37］探究了3D打印GelMA水凝胶支架联合骨髓间充质干细胞促进SCI修复的可能性，将支架植入SCI大鼠后与SCI损伤对照组大鼠比较，结果显示支架组的细胞存活率、再生脊髓组织数目和大鼠BBB评分等指标均高于对照组，表明该支架适宜细胞存活增殖、生物性良好等优良特性，可有效促进SCI修复。

3.2 3D打印聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是由乳酸和羟基乙酸随机聚合而成的一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性，并且没有毒性。SUN等［38］利用PLGA制造了一种多孔、亲水性高和生物降解性良好的仿生脊髓支架，并在该支架上评估雪旺细胞（SC）的发育情况。结果显示，SCs在PLGA支架上的发育增殖良好，作为周围神经系统中的神经胶质细胞，SCs发育良好表明该支架可以促进SCs连接和支持各种神经成分，并快速发挥分配营养物质、参与修复和吞噬的作用，加快了神经损伤的再生修复；
GFAP染色、Nissl染色、LFB染色和Bielschowsky银染也表明PLGA支架可显著促进脊髓的恢复。KAPLAN等［39］将PLLA和PLGA按1∶1混合后进行3D打印制造出了具有更高的孔隙率和良好的生物相容性的仿生脊髓支架，并将纤维蛋白负载到支架上共同植入大鼠脊髓的损伤处，结果显示，该支架可以引导轴突再生和突触形成，为脊髓神经组织再生提供了一个良好的微环境。

3.3 3D打印海藻酸钠-基质胶（SA-MA）支架 外胚间充质干细胞（EMSCs）是一种可分化为骨细胞、神经元和胶质细胞的成体干细胞。LI等［40］利用3D打印技术制造了一种海藻酸钠-基质胶（SA-MA）体外支架，并检测该支架对EMSCs分化和生长的影响效果。根据Higuchi方程，结合有EMSCs的支架结构具有生长因子BDNF的持续释放效应，并且支架上细胞存活率和分化效率均高于二维培养。SA-MA促进EMSCs神经元分化的能力为SCI治疗中的神经元再生提供了一种新的生物材料。

3.4 3D打印嗅鞘细胞结合水凝胶支架 许多活细胞，包括雪旺细胞、NSCs和嗅鞘细胞（OECs）等，已被用于促进神经修复再生。OECs是一种终身具有神经再生功能的再生细胞，它与雪旺细胞和胶质细胞在表现型上具有共同点，既存在于中枢神经系统，又存在于周围神经系统。OECs具有促进轴突生长和神经营养等作用，在神经再生时可以发挥多种作用，使其成为修复神经时的良好选择。在3D打印技术中，活细胞可以直接嵌入支架或者混合在打印介质中作为打印原材料。OECs可以透过星形细胞的疤痕，并缓解沿着伤口的神经轴突的生长发育［41］。OTHON等［42］利用生物激光打印技术（BioLP）在多层水凝胶支架上形成了数条OECs线，发现结合有打印得到的OECs的脊髓支架可使细胞间的相互作用增加，并使治疗药物集中于移植部位，对于脊髓损伤修复具有良好的促进作用。

3.5 3D打印神经引导导管结合多能间充质基质细胞支架 神经引导导管移植在短间隙缺损病变的治疗中具有良好的功能效果，但由于来源有限和传统制备困难，神经引导导管在长间隙缺损病变中应用十分局限。RODRÍGUEZ-SÁNCHEZ等［43］制备了3D打印的聚己内酯神经引导导管，并在异源纤维蛋白生物聚合物中嵌入了犬类多能间充质基质细胞作为细胞支架来研究其神经再生作用，通过体外炎症实验和植入坐骨神经损伤大鼠实验发现了该支架具有支持营养微环境和促进神经电生理恢复的积极作用，并且在脊髓微环境中可变为神经营养因子介导的促再生状态。

3.6 3D打印热响应聚氨酯（PU）水凝胶支架 聚氨酯（PU）弹性体是一类坚韧柔顺的热塑性弹性体，具有由硬段和软段组成的线性结构［44］。热响应性和可生物降解的PU分散体无需交联剂就可以在37℃附近形成凝胶，将NCSs嵌入在这种凝胶中可作为打印支架的原材料。HSIEH等［45］将嵌有NCSs的PU水凝胶支架用于斑马鱼创伤性脑损伤的实验研究，该支架促进了斑马鱼的CNS修复，使得创伤性脑损伤的成年斑马鱼的神经功能得以恢复。PU支架具有很强的机械强度、弹性以及支持细胞增殖的能力，使用结晶度较高的PU制成相关的支架，可使支架的降解速率适合纤维环（AF）的修复再生［46］。PU支架在SCI修复领域具有一定的应用潜力。

随着新型材料的出现和3D打印技术的发展，以改良胶原蛋白或其他新型材料制造3D打印仿生脊髓支架的动物实验研究成为了当前SCI修复研究的一个崭新方向，研究者通过SCI损伤动物模型验证了这些支架对于促进动物SCI修复的正向促进效果。

目前，3D打印技术在SCI乃至整个医学领域的应用越来越广泛。由于其个体化及精准化的特点，能更好地解决传统打印支架结构不完善、患者的个性化损伤问题，而且对脊柱外科的术前评估也有很大的帮助。尽管已有多种不同材料制造的3D打印脊髓支架在动物实验中取得了良好的效果，但对于不同材料制造的支架之间的疗效差异的研究还比较缺乏，没有得到一种公认的最科学有效的打印原材料，并且实验仅局限于动物，实际的临床效果仍是未知的。同时3D打印在SCI中的应用同样受到该技术本身的约束：（1）打印设备和原材料的价格昂贵，使得医用应用成本偏高；
（2）打印技术不够成熟，目前不能打印出软组织附着，如肌肉、血管和神经的走形和分布等；
（3）打印的准备周期较长。在脊柱外科应用中，构建所需的组织打印模型以及原材料的选择与准备均会耗费大量时间，可能会延误最佳的治疗时机［47］。

总之，3D打印的脊髓支架在动物实验中的理想修复效果为临床SCI的治疗提供了新的思路和方向，今后的研究可以以探究最佳打印原材料和临床实际应用效果为重心，得出3D打印技术用于促进临床SCI修复的可行性。虽然该技术仅处于动物实验阶段，尚未转化为临床应用，但其应用前景仍十分值得期待。

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