瓜蒌牛蒡汤对哺乳期乳腺炎小鼠的改善作用及机制研究*
时间：2023-03-02 13:50:05 来源：千叶帆 本文已影响人
张立清 李 婕 洪秀宇 聂 娟 肖建琴
浙江省安吉县中医医院 1 外科 2 医教科 313300
哺乳期乳腺炎(Lactation mastitis，LA)是哺乳期妇女的常见多发病，临床症状为乳房结块肿胀疼痛，伴有全身发热感染症状[1]。其发病原因多为乳管阻塞后乳汁分泌不畅、或乳头破损引起金葡萄球菌等感染性细菌直接或间接入侵乳腺组织引发感染所致，严重者可累及全身[2-3]。但随着对LA的深入研究，对其认知已从单纯感染性疾病过渡到免疫炎症性疾病[4]。Toll样受体4(TLR4)信号通路激活与LA患者体内炎症因子水平升高，与LA局部疼痛和全身感染症状密切相关[4-6]。
中医认为LA与“乳痈”症状类似，常用内服、外敷中药方剂，并配合手法通乳对其进行对症治疗[7]。临床研究发现，内服瓜蒌牛蒡汤治疗可较大程度降低LA患者全身的炎症反应、缓解乳房疼痛不适感并减轻乳汁淤积[8-10]，但其作用机制尚不明确。因此，本研究通过建立乳腺炎体内、体外模型，探究瓜蒌牛蒡汤防治LA的作用机制。
1.1 材料
1.1.1 动物与材料：小鼠乳腺上皮细胞EMT6细胞(赛百慷)；
脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS；
货号：L2880，Sigma)；
小鼠的白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、IL-1β、IL-10的ELISA试剂盒(货号：SBJ-M0044、SBJ-M0027、SBJ-R0095，森贝伽)；
小鼠肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的ELISA试剂盒(货号：MM-0132M2，酶免)；
小鼠IL-12的ELISA试剂盒(货号：ZC-36383，zcibio)；
β-actin、核因子κB(NF-κB-p65)、p-NF-κB-p65、TLR4、TNF-α抗体(货号：3700S、8242S、3033S、14358S、3707S，CST)；
CCK-8试剂盒(货号：HY-K0301，MCE)；
BCA蛋白定量试剂盒(货号：pc0020，Solarbio)。20只SPF级健康SD大鼠、36只ICR孕鼠均购于上海西普尔—必凯实验动物有限公司[动物生产许可证号SCXK(沪)2018-0008]，常规饲养于杭州鹰旸生物科技有限公司动物中心[动物使用SYXK许可证号(浙)2020-0024]，批准号EYOUNG-20210108-01。
1.1.2 实验仪器：细胞培养箱(型号BB150，Thermo公司)：脱水机、包埋机(型号：JJ-12J、JB-P5，武汉俊杰电子有限公司)；
病理切片机(型号：RM2016，上海徕卡仪器有限公司)；
光学显微镜(型号：AE2000，Motic)：倒置荧光显微镜(型号：Nikon Eclipse Ti-SR，日本尼康)；
酶标仪(型号：CMaxPlus，MD)。
1.2 方法
1.2.1 瓜蒌牛蒡汤制备和含药血清制备：瓜蒌15g、牛蒡子12g、黄芩9g、栀子12g、金银花9g、连翘9g、蒲公英15g、炮山甲6g、皂角刺9g、陈皮9g、青皮9g、炒王不留行10g、漏芦9g、赤芍9g、甘草6g(药物均由广东一方制药有限公司提供)，加水煎熬制备成200ml瓜蒌牛蒡汤。随机挑选SD大鼠，分别灌胃等量蒸馏水、瓜蒌牛蒡汤(15g/kg)或头孢曲松钠(100g/kg)，连续7d。结束后在无菌条件下予麻醉行腹主动脉采血(5ml)，静置离心，获取正常血清和两种含药血清经处理后于-80℃冰箱中保存。
1.2.2 细胞处理及分组：EMT6细胞培养于RPMI 1640培养基，放置于5%CO2的恒温培养箱中传代培养。将1×105细胞取出接种于12孔细胞继续培养，待细胞长至培养基80%时，将细胞随机分为空白组(等量正常血清)，模型组(等量正常血清)，低、中、高瓜蒌牛蒡汤血清组(分别含5%、10%、15%瓜蒌牛蒡汤血清)及头孢曲松钠血清组(含10%头孢曲松钠血清)。除空白组外，各组细胞均加入1μg/ml的LPS，培养24h，随后各组加入相应血清干预24h。
1.2.3 CCK-8检测细胞活力：各组细胞接种于96孔板内，培养24h，每孔加入10μl CCK-8溶液，培养箱内孵育。用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算细胞活力。
1.2.4 雌鼠造模及分组：取产后5～7d的ICR雌鼠与崽鼠分笼子禁食1～3h，随机分为sham组、model组、不同剂量(7.5、15、30g/kg)瓜蒌牛蒡汤组和阳性药物组(100mg/kg)，每组6只。腹腔注射0.3%戊巴比妥钠溶液对雌鼠进行麻醉后，仰卧固定，暴露乳头，酒精棉球局部消毒，剪去1mm乳尖，充分暴露出乳导管，往第四对乳腺乳池注入0.2mg/ml的LPS(sham组在该手术操作下不进行LPS注射)。造模后sham组、model组雌鼠给予等量生理盐水灌胃，各瓜蒌牛蒡汤组雌鼠分别灌胃7.5g/kg、15g/kg、30g/kg的瓜蒌牛蒡汤，阳性药物组雌鼠灌胃100 mg/kg头孢曲松钠，给药治疗4周。完成后安乐死雌鼠，经腹主动脉采血，离心收集血清保存备用。
1.2.5 HE染色：取各组雌鼠乳腺组织，常规石蜡包埋、切片，行HE染色，经苏木素染色5min，自来水冲洗，盐酸乙醇分化30s，自来水浸泡，伊红液复染2min，自来水冲洗，常规脱水，透明，封片。显微镜观察HE染色切片。
1.2.6 ELISA检测：按照ELISA试剂盒说明书，对各细胞组上清液IL-6、TNF-α、IL-1β含量和雌鼠血清IL-12、IL-10、IL-1β含量进行测定。
1.2.7 Western blot检测：离心收集各组细胞，制备雌鼠乳腺组织匀浆。裂解细胞和乳腺组织，提取蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳，分离目标蛋白，转至PVDF膜，TBST洗膜。行免疫印迹反应，封闭液封闭，加含一抗稀释液(TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α)，4℃过夜孵育，加相应二抗，室温摇床振荡反应1～2h。以β-actin为内参，化学发光仪显影，chemi capture软件分析图像，测定各组细胞中蛋白表达。
2.1 瓜蒌牛蒡汤对乳腺炎细胞活力的影响 如图1所示，与空白组相比，模型组细胞活力显著降低(P<0.01)。与模型组相比，中、高瓜蒌牛蒡汤血清组和头孢曲松钠组细胞活力显著提高(P<0.05或P<0.01)，而低瓜蒌牛蒡汤血清组细胞活力无显著性差异(P>0.05)。
2.2 瓜蒌牛蒡汤对乳腺炎细胞IL-6、TNF-α、IL-1β含量的影响 如图2所示，与空白组相比，模型组IL-6、TNF-α、IL-1β含量均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，中、高瓜蒌牛蒡汤血清组和头孢曲松钠组细胞IL-6、TNF-α、IL-1β含量均显著降低(P<0.05或P<0.01)，而低瓜蒌牛蒡汤血清组则无显著性差异(P>0.05)。
图1 各组乳腺炎细胞活力情况(n=3)
2.3 瓜蒌牛蒡汤对乳腺炎细胞TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表达的影响 如图3所示，与空白组相比，模型组细胞中TLR4、p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、TNF-α蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，中、高瓜蒌牛蒡汤血清组和头孢曲松钠组细胞TLR4、p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、TNF-α蛋白表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)；
而低瓜蒌牛蒡汤血清组细胞的p-NF-κB-p65/NF-κB-p65蛋白表达显著下降(P<0.05)，TLR4、TNF-α蛋白表达则无显著差异(P>0.05)。
图2 各组乳腺炎细胞IL-6、TNF-α、IL-1β含量情况(n=3)
图3 各组乳腺炎细胞TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表达情况(n=3)
2.4 瓜蒌牛蒡汤对乳腺炎组织病理变化的影响 如图4所示，sham组小鼠组织内乳腺细胞形态正常、结构完整且未见炎性细胞，而model组组织内乳腺细胞出现肿胀、积聚。随着瓜蒌牛蒡汤组剂量的增加，LA小鼠组织内乳腺细胞肿胀和积聚程度减轻，细胞形态趋于正常。阳性药物组组织内乳腺细胞的改善最为显著。
2.5 瓜蒌牛蒡汤对乳腺炎小鼠血清中IL-12、IL-10、IL-1β含量的影响 如图5所示，与sham组相比，model组血清中IL-12、IL-1β含量显著升高(P<0.01)，而IL-10含量显著下降(P<0.01)。与model组相比，15、30g/kg瓜蒌牛蒡汤组和阳性药物组血清IL-12、IL-1β含量显著下降(P<0.05或P<0.01)，7.5g/kg瓜蒌牛蒡汤组血清IL-12、IL-1β含量无显著差异(P>0.05)；
而15、30 g/kg瓜蒌牛蒡汤组和阳性药物组血清IL-10含量显著上升(P<0.05或P<0.01)，7.5g/kg瓜蒌牛蒡汤组血清IL-10含量无显著差异(P>0.05)。
图4 各组小鼠乳腺组织形态(HE,×100,×200)
图5 各组乳腺炎小鼠血清中IL-12、IL-10、IL-1β含量情况(n=3)
2.6 瓜蒌牛蒡汤对乳腺炎组织TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表达的影响 如图6所示，与sham组相比，model组组织TLR4、p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、TNF-α蛋白表达均显著升高(P<0.01)。与model组相比，各剂量瓜蒌牛蒡汤组和阳性药物组组织p-NF-κB-p65/NF-κB-p65蛋白表达均显著下降(P<0.05或P<0.01)；
15、30g/kg瓜蒌牛蒡汤组和阳性药物组组织TLR4蛋白表达显著下降(P<0.05或P<0.01)，7.5g/kg瓜蒌牛蒡汤组组织TLR4蛋白表达无显著差异(P>0.05)；
30g/kg瓜蒌牛蒡汤组和阳性药物组组织的TNF-α蛋白表达显著下降(P<0.01)，7.5、15g/kg瓜蒌牛蒡汤组组织TNF-α蛋白表达无显著差异(P>0.05)。
中医提出治疗LA应按照不同分期进行辨证治疗，初期应以疏肝清胃、通乳消肿为主，主张用瓜蒌牛蒡汤行“清”之功效，积极提高中医证候改善率[11-12]。瓜蒌牛蒡汤配方组成丰富，其中的瓜蒌、牛蒡子、金银花、连翘、蒲公英具有清热消痈肿功效，王不留行、皂角、陈皮可健脾活血通乳[9]。现代药理学探索发现瓜蒌中活性成分可作用于生物过程中炎症反应的靶点[13]，而牛蒡子苷元可介导TLR4炎症信号抑制LPS诱导的炎性细胞因子分泌[14]。
表达于乳腺细胞表面的TLR4可由细菌特异性成分LPS激活，随后将信号传导至胞内触发下游核因子κB(NF-κB)表达，产生促炎细胞因子引起组织炎症[15]。TLR4/NF-κB信号通路激活引起炎性细胞因子异常升高是乳腺炎小鼠局部炎症和全身免疫应答的关键环节[16]。既往研究结果表明，在LPS诱导小鼠后会引起乳腺组织内TLR4/NF-κB信号通路激活，组织和血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平增加，而抑制TLR4/NF-κB信号通路能够降低LA小鼠炎症因子水平、提高抗炎细胞因子IL-10水平，减轻小鼠症状[17-19]。TNF-α是一种多功能型的促炎性细胞因子，其在乳腺组织高表达能够调控炎性细胞因子生成，引起乳腺细胞凋亡和组织炎症损伤[20]。
在本研究中，乳腺细胞及组织经LPS诱导后TLR4/NF-κB信号通路及TNF-α表达均上调，炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12含量上升。而瓜蒌牛蒡汤则能抑制TLR4/NF-κB信号通路和TNF-α的表达，降低促炎性细胞因子水平，提高抗炎细胞因子IL-10水平，体现为乳腺炎细胞活力提升、乳腺炎组织淤积程度减轻，且该作用具有剂量效应。
图6 各组乳腺炎组织中TLR4、NF-κB-p65、p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白表达情况(n=3)
综上所述，瓜蒌牛蒡汤改善LA的作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB、TNFα炎症表达，继而降低炎性因子水平有关。本研究为瓜蒌牛蒡汤临床治疗LA提供了理论依据。
猜你喜欢 雌鼠牛蒡乳腺炎 乳腺炎性肌纤维母细胞瘤影像学表现1例中国临床医学影像杂志(2022年6期)2022-07-26哺乳期乳腺炎必须用抗生素吗中国生殖健康(2020年8期)2021-01-18变性的雄鼠做人与处世(2020年10期)2020-06-29哺乳期乳腺炎必须用抗生素吗中国生殖健康(2018年3期)2018-11-06牛蒡的储藏农村百事通(2018年13期)2018-09-13组蛋白乙酰化对衰老雌鼠胚胎发育影响的研究科技创新与品牌(2018年5期)2018-07-24甘肃鼢鼠繁殖季节变化的研究新农村(2018年35期)2018-04-02牛蒡之心小说界(2017年3期)2017-06-02牛蒡子中牛蒡苷测定方法的优化中成药(2016年4期)2016-05-17消炎散结通乳汤治疗乳腺炎100例中医研究(2014年10期)2014-03-11 相关热词搜索：牛蒡，乳腺炎，哺乳期，
