复方甘草酸苷对带状疱疹后遗痛大鼠脊髓背角PINK1/Parkin相关神经细胞自噬的影响

田佳玉 冯丹 张书力 胡焓 李少军 (武汉市第一医院疼痛科,湖北 武汉 430000)

带状疱疹后遗痛(PHN)是指带状疱疹消退后遗留的顽固性神经病理性疼痛,常表现为持续性、阵发性刺痛、刀割痛、跳痛、灼痛等,该病治疗难度大,病程时间长且易反复,严重影响患者生活质量〔1～3〕。脊髓背角是痛觉传导的重要部位之一,具有加工、处理、整合痛信息等作用,资料显示PHN 的产生、发展与病毒感染后的组织损伤及炎症引起的脊髓背角损害密切相关〔4〕,张爱民等〔5〕研究表明PHN 病情的维持机制可能与脊髓相关神经过度自噬有关,因此探究具有调节相关神经细胞自噬活性的药物对于治疗PHN 具有重要的意义。复方甘草酸苷具有抗炎、抗病毒、免疫调节等多种生物活性,虞红等〔6〕研究表明在PHN 治疗早期加服复方甘草酸苷片可明显缩短患者的疼痛痊愈时间,并减少PHN 不良反应的发生,因此推测复方甘草酸苷可能与调节机体炎症因子表达及神经细胞自噬有关,但其作用机制仍不清晰。PINK1/Parkin 信号通路是目前已知的介导细胞线粒体自噬的重要途径,Parkin 是细胞清除受损线粒体的关键蛋白,可能与PHN 脊髓背角相关神经元退行性病变有一定的关联〔7,8〕。本研究探讨复方甘草酸苷对PHN 大鼠脊髓背角PINK1/Parkin 信号通路及相关神经细胞自噬的影响。

1.1 动物 健康SPF 级SD 雄性大鼠(北京生命科学研究所动物实验中心),约3月龄,体重(175～220 g),生产许可证号:SYXK(京)2015-0002。所有实验大鼠于本院动物房中饲养,相对湿度55%,温度25℃,自然光照,自由进食、进水,每周清洁一次鼠笼、保持动物房环境通风、整洁、每天更新食物及饮用水,适应性喂养1 w。本研究经动物伦理委员会批准同意。

1.2 主要试剂及仪器 复方甘草酸苷(货号:H20073723)购于乐普药业股份有限公司;树脂毒素(RTX,货号:57444-62-9)购于北京寰宇科技;大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、干扰素(IFN)-γ ELISA 试剂盒、兔源LC3、Beclin-1、p62、PINK1、Parkin 一抗、β-actin、羊抗兔二抗(货号ab208348、ab197742、ab239425、ab192890、ab256743、ab109012、ab216144、ab77924、ab8226、ab150077)购于美国Abcam 公司;蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(货号P0027、P0011)购于上海碧云天公司等。

爪触觉测试仪、电子触觉测量仪、足底热刺激仪(型号:37450、38450、37370)购于深圳市瑞沃德生命科技有限公司;全自动生化分析仪(型号PUZS-300)购于上海帝博思生物科技有限公司;手动轮转式切片机(型号RM2125RTS)购于德国Leica 公司;光学显微镜(型号SMZ745)购于日本尼康公司;透射电镜(型号:LVEM5)购于美国Quantum Design;酶标仪(型号XElx800)购于美国Perkin Elmer 公司;蛋白电泳仪、半干转膜仪(型号1659001、Trans-Blot SD)购于美国Bio-Rad 公司;凝胶成像仪(型号:GIS-500)购于Miulab 公司等。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备及分组给药 参考文献〔9〕制备PHN 大鼠模型,选取40 只大鼠,按照随机数字法分为对照组、模型组、复方甘草酸苷低剂量组(10 mg/kg,简称LD 组)、复方甘草酸苷中剂量组(20 mg/kg,简称MD 组)、复方甘草酸苷高剂量组(30 mg/kg,简称HD 组),每组8 只,按照1 mg RTX、25 ml溶剂(2.5 ml 吐温80,2.5 ml 无水乙醇,20 ml 生理盐水)的比例制备RTX 溶液,除对照组腹腔注射等量溶剂,其余各组均腹腔注射RTX 溶液(250 μg/kg);造模前后测定各组大鼠的足底机械痛及热痛阈值判断建模是否成功,造模后模型组痛阈值显著下降,与对照组比较有统计学意义时即为模型构建成功。本实验中32 只大鼠均建模成功。模型构建后2 w 开始给药,给药剂量参照人体表法计算,成年人标准体重60 kg,每日复方甘草酸苷最大用量200 mg,因此设定大鼠给药剂量分别为10、20、30 mg/kg,复方甘草酸苷药物用生理盐水配制,LD、MD、HD 组按照各组给药剂量行灌胃处理,模型组、正常组灌胃等量生理盐水,持续灌胃2 w〔10〕。

1.3.2 大鼠机械痛阈值测定 将大鼠置于爪触觉测试仪玻璃箱中,测试之前适应30 min,将电子触觉测量仪对准大鼠的足底部,记录大鼠缩足时电子触觉测量针的刺激力度,记录对照组、模型组、LD、MD、HD 组右后爪造模第0、3、7、10、14 天、给药第3、7、10、14 天的机械痛觉阈值(MWT),每只大鼠测量5 次,每次间隔5 min,计算其平均值。

1.3.3 大鼠热痛阈值测定 将大鼠置于足底热刺激仪玻璃箱中,测试之前适应30 min,用热辐射刺激仪照射大鼠足底部的玻璃板,记录从照射开始到大鼠缩足所经历的时间,记为热缩足潜伏期(TWL),为防止大鼠烫伤将时间上限设为20 s,分别记录对照组、模型组、LD、MD、HD 组各大鼠右后爪造模第0、3、7、10、14 天、给药第3、7、10、14 天的TWL 值,每只大鼠测量5 次,每次间隔5 min,计算其平均值〔11〕。

1.3.4 大鼠脊髓背角标本采集 各组大鼠热痛阈值测定结束后24 h 将大鼠麻醉,用含有4%多聚甲醛、0.25%戊二醛的0.1 mol/L 磷酸缓冲液进行心脏灌注,待大鼠四肢僵硬后低温下取其L4-L5 段脊髓背角,3 只大鼠的脊髓背角组织用于炎症因子测定,2 只用于透射电镜观察,3 只用于相应蛋白表达检测。

1.3.5 大鼠脊髓背角炎症因子测定 随机取

1.3.4 中3 只大鼠的脊髓背角组织,称重后剪碎,加入磷酸盐缓冲液(PBS)后制备成10%的匀浆液,离心取上清液,按照试剂盒说明书的操作检测TNF-α、IL-1β、IFN-γ 的水平。

1.3.6 大鼠脊髓背角自噬情况观察 随机取

1.3.4 中2 只大鼠的脊髓背角组织,于2.5%戊二醛中固定过夜(4℃),用1%四氧化锇室温固定1 h,双蒸水浸洗3 次后用不同浓度梯度(50%、70%、90%、100%)的乙醇溶液处理,经过丙酮脱水、环氧树脂包埋后制成超薄切片,用3%枸橼酸铅染色,然后在透射电镜下观察脊髓背角神经元自噬情况。

1.3.7 大鼠脊髓背角自噬相关蛋白及PINK1/Parkin 信号通路相关蛋白表达测定 随机取1.3.4 中3 只大鼠的脊髓背角组织,根据蛋白质提取试剂盒的要求对各组大鼠脊髓背角组织中的总蛋白进行提取,参照BCA 试剂盒的说明书测定其中蛋白浓度,用SDS-PAGE 分离等量蛋白质后转移至PDVF 膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h,在4℃下加入1 ∶2 000 的兔抗鼠LC3(1 ∶800)、Beclin-1(1 ∶800)、p62、PINK1(1 ∶400)、Parkin(1 ∶800)、β-actin 一抗(1 ∶1 000),于4℃冰箱中孵育过夜,经TBST 漂洗3 次,加入1 ∶1 000的羊抗兔二抗溶液,于摇床上室温孵育2 h,经TBST 再次漂洗3 次,采用增强化学发光法显色,以凝胶成像仪观察条带并拍照,并以Image-J 软件分析各组大鼠脊髓背角组织自噬相关蛋白(LC3 Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、p62)、PINK1/Parkin 信号通路相关蛋白(PINK1、Parkin)的表达。

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0 软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2.1 各组MWT 比较 模型组、LD 组、MD 组、HD组大鼠MWT 值在造模第3 天时出现明显下降(P＜0.05),且在造模第10 天时达最低值,在造模第14 天时仍持续较低水平;给药处理后,与对照组相比,不同时间点模型组大鼠MWT 值均显著降低(P＜0.05),与模型组相比,不同时间点复方甘草酸苷各剂量组MWT 值均显著升高(P＜0.05),且呈现一定的剂量效应关系,其中HD 组效果较优。见表1。

表1 各组造模及给药后MWT 比较(±s,g,n=8)

表1 各组造模及给药后MWT 比较(±s,g,n=8)

与对照组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05;与LD 组比较:3)P＜0.05;与MD 组比较:4)P＜0.05;与本组前一时点比较:5)P＜0.05,下表同

组别造模第0 天造模第3 天造模第7 天造模第10 天造模第14天对照组38.01±5.4338.12±5.4336.93±5.2537.84±5.4037.03±5.27模型组37.84±5.4030.63±3.871)5)19.33±2.321)5)11.82±1.481)5)12.06±0.941)LD 组38.03±5.4329.76±3.721)5)18.26±2.141)5)12.66±2.041)5)12.85±1.071)MD 组37.91±5.4130.39±3.831)5)20.03±2.431)5)12.34±2.091)5)13.39±1.161)HD 组37.72±5.3830.90±4.011)5)19.37±2.331)5)11.13±1.381)5)12.97±1.091)F/P 值0.003/1.0003.379/0.02932.204/0.00074.816/0.00090.830/0.000组别给药第3 天给药第7 天给药第10 天给药第14天对照组37.69±5.3838.07±5.4437.92±5.4237.88±5.41模型组12.38±1.161)13.26±1.341)13.91±1.411)14.20±1.461)LD 组17.66±2.041)2)18.03±2.101)2)18.98±2.261)2)20.06±2.441)2)MD 组22.03±2.771)2)3)22.88±3.011)2)3)23.69±3.041)2)3)25.27±3.311)2)3)HD 组27.59±3.691)2)3)4)28.37±3.821)2)3)4)30.82±4.231)2)3)4)31.18±4.291)2)3)4)F/P 值42.384/0.00038.816/0.00035.543/0.00032.099/0.000

2.2 各组热痛阈值比较 模型组、LD 组、MD 组、HD 组TWL 值在造模第3 天时出现明显升高(P＜0.05),且在造模第10 天时达最高值,在造模第14 天时仍持续较高水平;给药处理后,与对照组相比,给药不同时间点模型组TWL 值显著升高(P＜0.05),与模型组相比,复方甘草酸苷各剂量组TWL值显著降低(P＜0.05),且呈现一定的剂量效应关系,其中高剂量组效果较优。见表2。

表2 各组造模及给药后TWL 比较(±s,s,n=8)

表2 各组造模及给药后TWL 比较(±s,s,n=8)

组别造模第0 天造模第3 天造模第7 天造模第10 天造模第14天对照组7.31±0.607.20±0.606.99±0.588.02±0.687.84±0.65模型组8.07±0.6715.33±1.271)5)22.17±1.841)5)25.11±2.091)5)23.37±1.941)LD 组7.06±0.5815.06±1.251)5)23.06±1.921)5)24.60±2.051)5)23.98±1.991)MD 组8.01±0.6614.97±1.241)5)22.80±1.901)5)25.39±2.111)5)24.06±2.001)HD 组7.90±0.6515.28±1.271)5)23.79±1.981)5)24.68±2.051)5)23.11±1.921)F/P 值2.590/0.06847.468/0.00085.873/0.00081.123/0.00078.992/0.000组别给药第3 天给药第7 天给药第10 天给药第14天7.35±0.567.44±0.576.89±0.537.39±0.61模型组23.88±1.831)23.06±1.771)22.94±1.761)22.37±1.861)LD 组21.20±1.631)2)20.14±1.541)2)19.49±1.491)2)17.94±1.491)2)MD 组18.37±1.411)2)3)17.26±1.321)2)3)16.84±1.291)2)3)15.06±1.251)2)3)HD 组15.44±1.181)2)3)4)14.39±1.101)2)3)4)13.55±1.041)2)3)4)12.33±1.021)2)3)4)F/P 值104.447/0.000102.049/0.000112.372/0.000对照组92.438/0.000

2.3 各组脊髓背角炎症因子比较 与对照组相比,模型组大鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β、IFN-γ 水平显著升高(P＜0.05);与模型组相比,复方甘草酸苷各剂量组脊髓背角TNF-α、IL-1β、IFN-γ 水平均显著降低(P＜0.05),且呈现一定的剂量效应关系,其中高剂量组效果较优。见表3。

表3 各组脊髓背角TNF-α、IL-1β、IFN-γ 水平及脊髓背角组织神经自噬相关蛋白表达比较(±s,n=3)

表3 各组脊髓背角TNF-α、IL-1β、IFN-γ 水平及脊髓背角组织神经自噬相关蛋白表达比较(±s,n=3)

组别TNF-α(ng/mg)IL-1β(ng/mg)IFN-γ(ng/mg)LC3Ⅱ/LC3ⅠBeclin-1/β-actinp62/β-actin对照组2.46±0.270.87±0.090.96±0.110.22±0.040.36±0.050.94±0.08模型组10.71±1.091))2.54±0.281)2.69±0.281)1.02±0.171)1.07±0.111)0.19±0.031)LD 组8.03±0.891)2)1.97±0.211)2)2.08±0.231)2)0.77±0.151)2)0.86±0.171)2)0.41±0.041)2)MD 组6.25±0.591)2)3)1.50±0.161)2)3)1.61±0.171)2)3)0.56±0.111)2)3)0.67±0.081)2)3)0.59±0.061)2)3)HD 组4.44±0.481)2)3)4)1.15±0.121)2)3)4)1.23±0.131)2)3)4)0.34±0.071)2)3)4)0.44±0.071)2)3)4)0.77±0.091)2)3)4)F/P 值57.907/0.00038.813/0.00037.661/0.00037.257/0.00038.255/0.000105.218/0.000

2.4 各组脊髓背角透射电镜观察 对照组脊髓背角神经元细胞核、内质网、溶酶体、线粒体形态基本正常;与对照组相比,模型组核膜凸凹不平,细胞核固缩,溶酶体形态异常,线粒体肿胀、变形甚至裂解,有明显的自噬囊泡存在,可见到自噬囊泡中高电子密度的自噬体;与模型组相比,复方甘草酸苷各剂量组脊髓背角神经元自噬情况均得到改善,其中高剂量组改善效果较好。见图1。

图1 各组脊髓背角透射电镜观察(×1 000)

2.5 各组脊髓背角神经自噬相关蛋白表达比较与对照组相比,模型组脊髓背角组织LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1 表达显著升高(P＜0.05),p62 表达显著降低(P＜0.05);与模型组相比,复方甘草酸苷各剂量组脊髓背角组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1 表达水平均降低(P＜0.05),p62 表达水平均升高(P＜0.05),且呈现一定的剂量效应关系,其中高剂量组效果最优。见表3、图2。

图2 各组脊髓背角组织神经自噬相关蛋白及PINK1/Parkin 信号通路相关蛋白表达

2.6 各组脊髓背角PINK1/Parkin 信号通路相关蛋白表达比较 与对照组相比,模型组脊髓背角组织PINK1、Parkin 蛋白表达升高(P＜0.05);与模型组相比,复方甘草酸苷各剂量组大鼠脊髓背角组织PINK1、Parkin 蛋白表达水平均降低(P＜0.05),且呈现一定的剂量效应关系,其中高剂量组效果最优。见图2、表4。

表4 各组脊髓背角组织PINK1/Parkin信号通路相关蛋白表达(±s,n=3)

表4 各组脊髓背角组织PINK1/Parkin信号通路相关蛋白表达(±s,n=3)

组别PINK1/β-actinParkin/β-actin对照组0.29±0.020.34±0.03模型组1.06±0.111)1.22±0.111)LD 组0.79±0.071)2)0.91±0.101)2)MD 组0.61±0.061)2)3)0.69±0.091)2)3)HD 组0.48±0.051)2)3)4)0.51±0.061)2)3)4)F/P 值55.487/0.00051.281/0.000

RTX 是辣椒素的超能类似物,能诱发类似PHN的疼痛,研究发现腹腔注射RTX 会使大鼠出现与PHN 临床表现相似的痛觉过敏、痛觉超敏,且构建的PHN 大鼠模型安全且可靠〔12〕,本研究结果显示,造模第3 天时MWT 值出现明显下降,TWL 值出现明显升高,这与PHN 患者临床表现类似,表明PHN大鼠模型构建成功。临床治疗PHN 的方法主要有神经阻滞、神经调节、介入治疗等,研究发现加服地塞米松等糖皮质激素可显著减轻后遗痛的发生〔12,13〕,但患者常会因糖皮质激素类药物易产生诸多不良反应而拒绝使用,因此探究治疗PHN 的相关药物仍是研究中的热点。复方甘草酸苷化学结构类似于皮质类固醇,具有抑制病毒增殖、灭活病毒、提高机体抗病毒能力、抗炎、免疫调节等作用,研究表明在治疗早期服用复方甘草酸苷可有效缓解PHN病情,治愈率及有效率较好,且患者耐受性好〔14〕。本研究结果表明复方甘草酸苷对PHN 大鼠后遗痛具有一定的缓解作用,但其作用机制仍不清晰。

PHN 发病与带状疱疹病毒引起的感觉神经大面积损伤、急性神经炎症密切相关,脊髓在神经性病理疼痛发生发展中起到重要作用,越来越多研究发现脊髓背角炎症及相关神经细胞过度自噬在PHN疼痛、感觉异常等症状中发挥重要作用〔15〕。细胞自噬是细胞利用自噬体吞噬异物及受损的细胞器对细胞内物质进行周转的一种生理活动,自噬活动稳定对调节细胞内部稳定、维持细胞正常生命活动有重要意义,但炎症反应、神经系统损伤等引起的自噬紊乱常常会对机体造成不利影响〔16,17〕。LC3 存在于自噬体分离膜上,是自噬体形成的关键蛋白,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ可反映自噬体形成程度;Beclin-1 是能调控自噬前体的形成的一种基因,在自噬的启动中发挥重要作用〔18〕。本研究结果表明,脊髓中的炎症反应与神经元细胞自噬紊乱与PHN 密切相关,经过复方甘草酸苷治疗的大鼠脊髓背角中的炎症因子表达水平显著下降,神经元自噬紊乱得到一定的缓解,表明复方甘草酸缓解PHN 病情的机制可能与抑制脊髓背角炎症反应及调节相关神经细胞自噬有关。

PINK1/Parkin 信号通路与细胞自噬密切相关,在维持线粒体功能与代谢中发挥重要作用,PINK1与Parkin 之间共同作用调控线粒体自噬活性,其中PINK1 位于Parkin 上游,正常情况下PINK1 含量较低,当线粒体发生损伤时,PINK1 受到活化,进一步诱导线粒体自噬过程〔19〕。Chen 等〔20〕研究发现,激活PINK1/Parkin 信号通路后,自噬相关基因及蛋白表达显著降低,自噬点显著减少。本文研究结果提示,复方甘草酸苷具有一定的抑制PINK1/Parkin 信号通路激活的作用,可能与其缓解PHN 病情、抑制脊髓背角炎症反应及调节相关神经细胞自噬有关。

综上,复方甘草酸苷能缓解PHN 大鼠的疼痛行为学,降低PHN 大鼠脊髓背角相关神经自噬活性及炎性因子的表达,可能与抑制PINK1/Parkin 信号通路有关,但本文未进行相关通路激活剂进行对照试验,因此仍需深入研究。

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