西红康对2型糖尿病肾病大鼠肾足细胞功能的影响
时间：2023-03-04 11:55:04 来源：千叶帆 本文已影响人
玉山江 ·艾克木，哈丽达·木沙，王晓腾，郑 静
(1.新疆医科大学附属中医医院干一科，新疆 乌鲁木齐 830054; 2.新疆医科大学第一附属医院干部综合科，新疆 乌鲁木齐 830011)
糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一，白蛋白尿是评估DN进展的重要指标之一[1]。而研究发现肾足细胞超微结构的改变及其相关分子表达的变化在DN的发生与发展过程中发挥重要的作用，主要表现为肾足细胞的数量减少，且合并肾足细胞代偿性的肥大与足突胞体增宽，从而导致肾小球滤过屏障的通透性增加引发蛋白尿[2-3]。西红康具有益气养阴、滋补肝肾与活血化瘀的功效。前期的研究证实其可有效减少DN患者微量白蛋白排出，达到良好的治疗效果并显著提高患者生活质量[4]。本研究拟通过动物实验探讨西红康对2型糖尿病肾病肾脏足细胞结构的影响，从病理学角度探究西红康保护肾脏、降低尿蛋白的作用机制，为临床治疗提供依据。
1.1 实验动物与试剂 SPF级8周龄雄性Wistar大鼠50只，体重200～220 g，全部饲养自我院实验动物中心。晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidationprotein products，AOPPs)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒、链脲佐菌素(STZ)与微量尿白蛋白测定试剂盒购自美国 Sigma 公司；
固定试剂(3%戊二醛、1%锇酸)与脱水剂(50%、70%、90%的乙醇，90%的丙醇，90%的乙醇∶90%的丙酮=1∶1 混合液)购自南京建成生物工程研究所。包埋剂(Epon812 环氧树脂)；
光影染色液(0.5%的甲苯胺蓝)与电子染色剂(醋酸双氧铀、柠檬酸铅)购自中生北控生物科技股份有限公司。西红康购自我院中药房，并将其熬制成中药汤剂，塑料无菌包装。
1.2 分组及模型建立 将50只SPF级8周龄雄性Wistar大鼠分为空白对照组(n=10)和 DN模型组(n=40)，测量记录每只大鼠的初始体重。给予空白对照组大鼠普通饲料喂养，而DN模型组则予以高脂高糖饮食喂养。喂养8周后，DN模型组以小剂量STZ(15～25 mg/kg)腹腔注射诱导2型糖尿病模型(血糖≥16.7 mmol/L为2型糖尿病造模成功)，而空白对照组大鼠给予等体积0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液注射。将造模成功的DN大鼠随机平均分为四组：模型对照组(n=10)、西红康小剂量组(n=10)、西红康中剂量组(n=10)与西红康大剂量组(n=10)，给予各组大鼠普通饲料喂养外，西红康小、中、大剂量治疗组分别给予西红康3、6、12 g/(kg·d) 汤剂灌肠，空白对照组和模型对照组每日给予等体积0.9%氯化钠溶液灌肠，共饲养30 d。
1.3 动物取材及指标测定 干预结束后，大鼠剪尾取静脉血，用血糖仪测空腹血糖(FBG)水平，在根据AOPPs ELISA试剂盒说明书，按顺序加入标本、标准样、带有辣根过氧化物酶标记的检测抗体，然后温育并且彻底地洗涤，显色后应用酶标仪在吸收波长为450 nm波长下测定其吸光度，即可以计算出样品AOPPs的浓度；
收集12 h夜尿后严格按照微量尿白蛋白测定试剂盒说明书操作，根据其浊度结果得出样品中尿微量白蛋白(Microalbumin，mALB)水平。大鼠禁食12 h后，麻醉状态下解剖取出肾脏，取一部分肾皮质组织放于甲醛固定液中保存，标上编号送检。经脱水、渗透、包埋后切片，染色于电镜下观察。观察足细胞计数、足突平均宽度(FPW)及足突融合率、肾小球基底膜平均厚度(GBM)平均厚度，具体如下：①足细胞计数：每例至少观察3个肾小球，随机选取10个视野，计数足细胞个数。②足突宽度：测定足突两侧膜间的距离在裂化膜水平上，算出其平均值。③足突融合率：首先量出GBM总长度，标为X，然后量出 GBM 上足突合的总长度，设为Y，再用Y除以X，即为融合率。④GBM：将GBM 分成若干个点，然后在每点GBM测定其厚度，再相加各点服M的厚度设为X，其测定的点数设为Y，最后用X除以Y，即为各组GBM的平均厚度。
1.4 统计学方法 应用SPSS 24.0统计学软件对数据进行分析。计数资料采用卡方检验和Fisher精确检验；
计量资料用均数±标准差表示并采用独立样本t检验；
P<0.05为差异具有统计学意义。
2.1 空白对照组与DN模型组各项生化指标比较 DN模型组体重、FBG、FINS、HOMR-IR、TG、TC、mALB与AOPPs水平较空白对照组均明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 空白对照组与DN模型组各项生化指标比较
2.2 不同剂量西红康对大鼠FBG、mALB与AOPPs水平的影响 干预治疗30 d后，各剂量西红康治疗组与模型对照组比较，FBG、mALB与AOPPs水平均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，但各剂量治疗组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 不同剂量西红康对大鼠FBG、mALB与AOPPs水平的影响
2.3 不同剂量西红康对大鼠肾足细胞超微结构的影响 干预治疗30 d后，各剂量西红康治疗组与模型对照组比较，足细胞计数、足突宽度、足突融合率与GBM均明显增高或降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；
西红康大剂量组、西红康中剂量组与西红康小剂量组比较，足细胞计数、足突宽度、足突融合率、GBM差异均具有统计学意义(P<0.05)。随着西红康剂量的增加，大鼠肾小球GBM增厚、足突断裂、排列不整齐与足突融合(如图1中箭头所示)等现象明显减轻。见表3。
表3 不同剂量西红康对大鼠肾足细胞超微结构的影响
图1 不同剂量西红康对大鼠肾足细胞超微结构的影响(荧光染色，×400)
DN患者肾活检中早期特征性的病理变化是肾小球病变，主要病变为弥漫性肾小球硬化、结节性肾小球硬化和肾小球基底膜增厚[5]。弥漫性肾小球硬化是光镜下最早可观察到的病理变化，而随着DN病程的进展，弥漫性肾小球硬化逐渐发展为结节性肾小球硬化，而结节性病变也称为 Kimmelstiel-Wilson 结节，可在约25%的晚期DN患者中观察到[6]。弥漫性肾小球硬化与结节性肾小球硬化实际上是DN的两个阶段，与弥漫性肾小球硬化比较，已发展到结节性肾小球硬化的DN患者的肾功能损害更严重，且病程也更长，预后更差[7]。虽然肾小球病变一直是DN研究的重点，但最新的研究发现肾小球外病变也对疾病的发生与进展有重要的影响，肾小管间质病变包括肾小管萎缩、间质性炎症和肾小管间质纤维化，同样与肾功能损害密切相关[8-9]。DN是一种糖尿病性微血管病，因此肾小球入小动脉和肾小球出小动脉也会发生玻璃样变，而肾小球出小动脉玻璃样变也是DN与高血压肾病的鉴别要点[10-11]。实际上肾小球内皮细胞损伤、足细胞损伤等异常病变也和DN的发生与发展密切相关[12-13]。
本研究的结果发现不同剂量西红康干预后，大鼠AOPPs和尿微量白蛋白水平较前均明显减少组，但是西红康大剂量组、西红康中剂量组对大鼠肾小球GBM增厚、足突断裂、排列不整齐、足突融合等现象的改善作用明显优于西红康小剂量组，这说明西红康可减少尿白蛋白，改善肾功能，对DN的防治有重要的意义。目前临床上西医治疗老年糖尿病肾病短期疗效肯定，但长期治疗效果不明确[14]。西红康具备益气养阴与补肾活血的作用，不仅可有效调节血糖与血压，同时还可提高免疫力，对人体的血液循环系统、代谢系统与内分泌系统等均具有良好的调理作用[15]。当DN患者的肾脏足细胞密度和总数因受损伤凋亡、脱落减少，残留的足细胞足突会发生代偿性的增宽、融合与肥大，这会导致肾小球通透性增加，进而发生弥漫性肾小球硬化与结节性肾小球硬化[16-18]。蛋白尿的发生和足突融合、足突间隙增宽密切相关，而蛋白尿又会导致足细胞损伤，形成恶性循环，肾足细胞发生损伤后会发生足突融合、消失，胞体缩小及滤过屏障电荷减少，甚至形成假囊，最终导致足细胞凋亡、脱落以及肾小球滤过屏障的结构和功能变化[19-20]。
综上所述，西红康可降低2型糖尿病肾病大鼠的FBG、AOPPs与mALB水平，还可有效改善其肾足细胞超微结构，达到保护肾脏的作用。
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