流式细胞术在本科实验教学中的应用
时间：2023-03-10 20:40:04 来源：千叶帆 本文已影响人
吴映霞，陈笑霞，孙彩云，何祖勇，张楚英，张 雁
（中山大学生命科学学院，广州 510275）
流式细胞术是当今生命科学研究过程中非常重要的一种检测方法，已经广泛应用于细胞生物学、免疫学、血液学、医学、肿瘤学、生理学、遗传学、药学和微生物学等多个学科专业。流式细胞术是能够在非常短的时间内分析大量单个细胞的多种特征，同时分选靶细胞的高新技术［1-3］。凡是对流式细胞术的应用都离不开流式细胞仪，而流式细胞仪是指高速流动的细胞或者生物颗粒在激光的照射下，发射出散色光和荧光信号，并将这些光信号转换成电信号，再进一步转换成数字信息，从而分析出细胞或颗粒的物理属性和化学属性，同时还可以分选出靶细胞的仪器。在Medline 数据库中，从1970 年开始，有关流式细胞仪发表的文章呈指数增长，研究范围非常广泛［4］。
随着国家不断加大对高校科研和教学的投入，流式细胞仪等大型精密高端仪器为高校科研水平和综合实力的提升发挥了重要作用［5-6］。而掌握一门像流式细胞术这样的高端先进技术，在当今激烈的科研和就业竞争中越来越重要［7］。流式细胞仪由于其构造精密、操作复杂、价格昂贵，目前主要是用于科研［8］，并且由专门技术员或者研究生使用，本科生很难或者很少有机会操作这些大型贵重仪器［9-10］。这也是目前我国高校普遍存在的现象，大型精密仪器主要用在科研上，在本科教学中较少发挥作用，本科生对流式细胞仪知之甚少。这种现象在国外也存在［7］，像流式细胞术这种强大的分析技术，没有经过专业的培训，本科生要么不会使用，要么使用不当，从而阻碍了研究的进展，因此，现在很多高校把为本科生设置学习先进技术的课程，作为主要目标［11-13］。
生物科学综合实验是现代生命科学一门非常重要的综合性生物技能大型专业实验课程，对提高学生的生物实验技能和综合素质非常重要。为了向本科生普及流式细胞术的知识，学习不同学科技术，提高科研能力，同时针对大型精密仪器在本科教学中使用率低的问题，自2017 年起，对生物科学综合实验课程进行教学改革，引入流式细胞术，通过编写流式相关讲义、设计实验方案和操作步骤，对脂质体介导的细胞瞬时转染技术实验项目的实验手段予以补充和丰富。这样既可开拓学生的视野，又具有创新性，还能让学生掌握新的研究方法与技术。
下面以脂质体介导的细胞瞬时转染技术实验项目的教学为例，详细说明流式细胞术在生物科学综合实验教学中的应用。
在运用流体动力学设计的流动室里，样本在鞘液的包裹下，恒定的处于液流的中心位置，并且以单个细胞排列依次经过检测点，在激光的激发下，发射出不同的散射光（前向散射光FSC 和侧向散射光SSC）和荧光，这些光信号分别被不同的探测器接收并转换成电信号，电信号再转换为可识别的数字信息，经过电脑分析处理后形成流式图表，储存在电脑上以供分析，同时如果需要分选靶细胞，则依据分选决策，使带有靶细胞的液滴充上电荷，通过电极偏转板时，带不同电荷的液滴会发生吸引或排斥，进入适当的接收管中，从而分选出靶细胞。流式细胞仪的工作原理如图1 所示。
图1 流式细胞仪工作原理
从其工作原理中可见，流式细胞仪主要包括4 部分：①液流系统。将单个细胞依次排列送到激光照射区。②光学系统。产生并收集光信号。③信号处理系统。将光信号转换成电信号，再转换成数字化信息。④分选系统。给带有靶细胞的液滴充电，分选收集靶细胞。液流系统、光学系统和信号处理系统是每台流式细胞仪的基本组成部分，而分选系统则是具有分选功能的流式细胞仪才有。实验使用的流式细胞仪型号是BD Accuri C5，只有一个488 nm 激光器，不具有分选功能。
制作1 h的讲义，讲义涉及的内容有流式细胞术的原理、流式细胞仪组成部分及其作用、应用领域、常见名词解释和流式结果分析［14］。实验方案则在原来的生物科学综合实验中的脂质体介导的细胞瞬时转染技术基础上，增加使用流式细胞仪检测转染效率，全班分成若干小组，每组有3 个样品，分别是没有加入脂质体转染pmaxGFP 质粒的细胞（空白对照样品）、加入7.5 μL 脂质体转染pmaxGFP 质粒的细胞（低浓度样品）和加入15 μL 脂质体转染pmaxGFP 质粒的细胞（高浓度样品），这3 个样品先在倒置荧光显微镜中拍照观察并计算转染效率，再制备成单细胞悬液，通过流式细胞仪检测转染效率，最后比较这两种检测方法的差异。结合脂质体介导的细胞瞬时转染技术的教学内容，从细胞复苏开始，全部由学生自己动手操作。在操作仪器之前，老师首先向学生展示流式细胞仪的实体组成部分，接着由老师演示仪器的操作以及注意事项，最后每组的学生自己动手操作。上样过程中，实时教学生如何分析实验结果。实验结束后，学生自己在软件上分析原始数据，最后生成实验报告。
3.1 材料
CHO细胞 不加脂质体转染pmaxGFP 质粒的细胞（空白对照样品）、加入7.5 μL 脂质体转染pmaxGFP质粒的细胞（低浓度样品）、加入15 μL脂质体转染pmaxGFP质粒的细胞（高浓度样品），每组细胞所转染的pmaxGFP质粒为5 μg。
试剂 0.25%胰蛋白酶、DMEM 培养基、OPTIMEM® Reduced-Serum 培养基、胎牛血清、1 ×PBS。
设备 BD Accuri C5 流式细胞仪、倒置荧光显微镜、CO2培养箱、超净工作台、台式低速自动平衡离心机、移液器。
3.2 方法
3.2.1 脂质体介导法将pmaxGFP质粒转染细胞
脂质体介导法转染pmaxGFP 质粒的方法按LipofectamineTM3 000 转染试剂盒（Invitrogen，美国）的说明书进行。
3.2.2 在倒置荧光显微镜下观察pmaxGFP 质粒的表达情况
将各组细胞培养皿置于倒置荧光显微镜下观察，选择至少3 个视野拍照，观察每个视野下细胞的形态、荧光分布和强度等，并计数每个视野下细胞总数和转入pmaxGFP质粒而表达绿色荧光的细胞数，计算转染效率（荧光细胞／细胞总数），比较不同处理组之间的转染效率。
3.2.3 用流式细胞仪检测细胞转染pmaxGFP 质粒的转染效率
（1）在显微镜下拍照后的细胞，将培养基吸走，再用2 mL的1 ×PBS洗两次，洗掉残留的培养基。
（2）在60 mm的培养皿中加入0.5 mL 0.25%的胰蛋白酶，37 ℃孵育3 min，然后用移液器将细胞轻轻吹散，再加入0.5 mL 10%FBS，使胰蛋白酶失活。
（3）将细胞悬液移入装有4 mL DMEM 培养基的15 mL离心管中，以200g速度离心5 min收集细胞，弃上清液，用3 mL 1 ×PBS重悬细胞，用移液器轻轻分散细胞20～30 次。
（4）将细胞悬液转移到装有细胞过滤器的5 mL流式管中，准备上样。
（5）在BD Accuri C5 流式细胞仪的操作软件上，先画出FSC＆SSC点图，横纵坐标采用线性放大模式；
接着画GFP＆SSC点图，横坐标GFP 采用对数放大模式；
最后画GFP单参数直方图。
（6）根据软件设置，在96 孔样本板上每一个孔代表一个样品，点击每个样品孔，命名，再点击RUN 上样，设置上样条件，记录20 000 个P1 门中的细胞。
（7）样品上完后，可从软件的分析面板和统计面板中得到统计结果。
pmaxGFP质粒携带绿色荧光蛋白GFP，GFP 在488 nm 蓝光激发下，会发射出530 nm 左右的绿色荧光，在常规的倒置荧光显微镜下便可观察到转染GFP质粒的细胞。本实验以脂质体介导法将pmaxGFP 质粒转入细胞中，在倒置荧光显微镜中初步观察的结果（以其中一组学生结果为例）如图2 所示，空白对照样品的细胞没有表达绿色荧光蛋白［见图2（a）］，低浓度样品［见图2（b）］和高浓度样品［见图2（c）］转染pmaxGFP质粒后的阳性细胞呈绿色，低浓度样品的阳性细胞数目比高浓度样品的多，荧光亮度也较强。说明不加脂质体，pmaxGFP 质粒不能进入细胞，加脂质体时，并非脂质体的浓度越高转染效率越高，选择合适浓度的脂质体才能获得最高的转染效率。
图2 倒置荧光显微镜下观察GFP在细胞中的表达情况
同样在流式细胞仪488 nm蓝光激发下，GFP能够发射出530 nm左右的绿光，本实验流式细胞仪检测细胞转染效率的结果如图3 和表1 所示。
FSC-A ＆ SSC-A是散射光点图［见图3（a）］，通过这个图先初步选择目标细胞群，再根据FSC-A ＆Width［见图3（b）］和SSC-A ＆ Width［见图3（c）］选择大小均一、颗粒度均一的目标细胞，最后再通过GFP直方图［见图3（d）］来分析阳性细胞的荧光强度。还可以通过在GFP直方图中叠加各个样品（见图4），从而更清晰地展示样品之间的差异。流式细胞仪能够自动统计每个样品的相对平均荧光强度，如表1 所示，阳性细胞越亮，相对平均荧光强度越强。从流式结果中可以得到，低浓度样品的荧光强度比高浓度样品的高，转染效率也较之高。通过流式细胞仪检测和倒置荧光显微镜观察的细胞转染效率结果是一致的，低浓度样品转入pmaxGFP 质粒的细胞比高浓度样品的效率要高。从这两种检测方法中可以看出，流式细胞仪检测细胞转染效率的结果要比显微镜观察记录的结果误差更低、更精确可靠、耗时更短。两种检测方法相结合，使该实验项目内容更丰富，实验结果更严谨。
图4 各样品中GFP对比图
表1 流式细胞仪检测样品中GFP相对荧光强度
图3 流式细胞仪检测GFP在细胞中的转染效率
把流式细胞术引入到生物科学综合实验课程的本科实验教学中，采用理论与实践相结合的方式，学生通过先了解学习流式细胞术的基本知识，对流式细胞仪产生浓厚的兴趣，再通过制备流式样品、观察仪器构造、操作仪器、分析实验结果等，来加深对流式细胞术的认识。这样的教学方式，充分调动学生的积极性和主动性，增强本科生动手能力，培养本科生的科研思维和分析能力，教学效果更显著。学生经过此次教改实验，从对“流式”一无所知，到了解流式细胞仪如何对单个细胞进行定量或定性分析，不仅学会了流式细胞术的原理和基本操作流程，还掌握了制备流式样品和分析结果的能力，学生们表示受益匪浅，对以后独立设计实验和提高科研分析能力都有很大的帮助。
流式细胞术能够对细胞进行定量或定性分析，在非常短的时间内能够检测大量细胞，且能够同时分析单个细胞的多种特性，是一种多功能、高通量、快速有效的生物检测技术。实践表明，在本科生的实验教学中传授流式细胞术知识，学生不仅能够综合运用多种实验技术，又可以使本科生了解更多新知识、新视野、新技术，同时培养了学生创新的科学素养，提高了课程的挑战度，为研究性教学提供新思路。另外，除了能提高本科生学习新技术的积极性和主动性以外，还能使大型精密贵重仪器的使用率增加。在以后的教学实践中，还尽可能将其他大型精密仪器开放给本科生学习使用，让本科生为将来的科研工作做好准备。
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