酿脓链球菌生物学特性及其检测方法应用进展

刘 爽 姚 粟 李 婷 翟 磊 姚晨之⋆

1.中国日用化学工业研究院有限公司，山西太原，030001；

2.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京，100015

酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）属于链球菌属，是乙型溶血性链球菌的一种，常存在于水、空气及人的口腔、鼻腔和咽喉。酿脓链球菌为兼性厌氧菌，在培养环境中添加5%二氧化碳有助于其生长及溶血性。酿脓链球菌致病机制较为复杂，能引起人的多种疾病，引起的相对轻微的非侵袭性疾病一般包括咽炎、急性扁桃体炎、急性输卵管炎[1]、脓包病、猩红热；
也可能引起侵袭性疾病，如坏死性筋膜炎、菌血症和链球菌中毒休克综合征；
还可以造成严重的非化脓性后遗症，如风湿性心脏病和急性肾小球炎[2-3]。呼吸道飞沫被认为是酿脓链球菌的主要传播途径，同时，接触该菌感染引起的溃疡或者被其污染的材料、器械也可能引起传播，食源性传播也有报道[4]。流行病学显示，酿脓链球菌感染的常见环境为医院、幼儿园、收容所等人群密集场所，具有时空聚集性[5]，个人和手卫生不良会加剧传播风险[6]，因此加强个人手部卫生和公共环境消毒来切断酿脓链球菌的传播是有效的预防措施。

对于酿脓链球菌的检测，目前最常用的是传统分离技术，但其过程烦琐、耗时较长，较为依赖肉眼观察结果，难以应对突发的公共卫生安全事件，也难以满足相关食品、用品快速流通的需求。本文对酿脓链球菌生物学特性及致病机制进行介绍，指出该菌的关键毒力因子，并总结了目前常见的酿脓链球菌检测方法，对寻找新的检测靶点，建立更准确、高效的酿脓链球菌快速检测方法，进一步加强对酿脓链球菌感染的预防有重要意义。

1.1 形态特性

酿脓链球菌为革兰氏阳性菌，菌体形态呈圆形或卵圆形，直径为0.5～1 μm。通常呈链状排列，不形成芽孢，有荚膜，无鞭毛，不运动。其菌毛具有抗原性，常应用于T血清型鉴定[7-8]。

1.2 培养特性

酿脓链球菌为兼性厌氧菌，初代培养需要5% CO2的环境以促进生长。最适生长温度为35～37 ℃，生长的pH为7.4～7.6。对营养要求较高，通常需要在普通培养基上补充血清、血液、腹水等。在液体培养基中易成长链，于管底呈絮状或颗粒状沉淀生长。在血琼脂平板上形成灰白色、透明或半透明、表面光滑或略粗糙、边缘整齐的圆形凸起细小菌落，菌落周围形成透明的溶血环[9]。有研究表明，酿脓链球菌的菌落形态有明显的M蛋白分型特异性[10]。此外，高浓度还原糖会抑制溶血[11]。

其液体培养基包括TSB肉汤（tryptic soy broth）、THB肉汤（todd-hewitt broth）和BHI肉汤（brain heart infusion broth）。THB肉汤通常用于酿脓链球菌血清学分型的培养。

1.3 生化特性

酿脓链球菌具有葡萄糖、乳糖和苹果酸摄取途径，优先使用葡萄糖作为主要能量来源[12]。不分解尿素，杆菌肽和链激酶实验呈阳性。过氧化氢酶活性为阴性。酿脓链球菌对青霉素、氨苄霉素等抗生素敏感。L-吡咯烷酮芳胺酶实验可将酿脓链球菌与无乳链球菌区分开，奥普托欣耐药实验呈阳性可分辨其与肺炎链球菌。

1.4 酿脓链球菌致病机制

酿脓链球菌主要定植于咽喉和皮肤的黏膜，导致各种形式的非侵入性或侵入性的感染及并发症。这些感染涉及呼吸道、皮肤和软组织以及血液，严重时甚至危及生命[13]。因此，了解酿脓链球菌的致病机制以及对其引起的疾病的监督非常重要，有利于为这些疾病的控制和预防奠定基础。流行病学调查结果显示不同菌株之间不仅存在通用的致病机制，还会因为具有不同遗传背景而具有独特的致病机制。本文对酿脓链球菌的通用致病机制进行概述。

1.4.1 酿脓链球菌的黏附定植

人类皮肤是一种不适宜细菌定植的环境，包括角质层的物理屏障、酸性表面pH值以及天然防御因子（如抗菌肽、蛋白酶、溶菌酶、细胞因子和趋化因子）的积极合成，这些因子共同用于募集免疫细胞和启动适应性免疫反应[14]。为了成功地在皮肤或咽喉中定植或建立感染，酿脓链球菌会依赖某些特异性的黏附因子，使得在定植过程中与组织上正常的常在菌群竞争时处于有利地位。在皮肤的黏附定植过程中，皮肤存在的伤口使酿脓链球菌更容易克服第一道屏障，同时酿脓链球菌也可以分泌某些毒力因子对咽喉上皮细胞或者皮肤上皮细胞造成直接损伤。研究表明，广谱半胱氨酸蛋白酶（SpeB）基因广泛存在于酿脓链球菌中，该酶可以降解宿主表面蛋白，破坏组织屏障，方便酿脓链球菌入侵宿主并建立感染。此外，有研究认为酿脓链球菌在不同的环境下会表达不同的黏附素以促进其进入皮肤深层组织，如介导了酿脓链球菌对上皮细胞黏附能力60%的脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）。

目前对酿脓链球菌黏附过程的代表性理论是两步法模型，即第一步是通过LTA介导细菌克服和宿主之间的静电斥力，这一黏附过程作用相对较弱，是可逆性黏附。第二步通过菌毛、M蛋白或血清混浊因子形成较为稳定的、非可逆的黏附。

1.4.2 入侵上皮细胞

酿脓链球菌具有一定的入侵上皮细胞的能力，主要依赖于M蛋白和纤连蛋白结合蛋白的表达。纤连蛋白是一种多结构域糖蛋白，由约250 kDa单体的二聚体组成，存在于人体体液、细胞表面和各种组织的细胞外基质[15]，酿脓链球菌通过纤连蛋白结合蛋白与纤连蛋白结合，并利用纤连蛋白与宿主整合素之间的亲和力，此处纤连蛋白的作用类似于酿脓链球菌黏附到宿主细胞的桥梁，进而激活包括磷酸肌醇3-激酶和整合素连接激酶等在内的信号通路，从而导致细胞骨架肌动蛋白的重排及形态变化，并通过几种不同的机制诱导细菌内化到宿主细胞中[16-17]。有研究从无法根治链球菌咽炎的患者扁桃体中发现侵入细胞内的酿脓链球菌，证明了酿脓链球菌入侵上皮细胞的现象[18]。

1.4.3 免疫逃逸

进入机体之后的酿脓链球菌还要克服各种不利的体内环境，主要包括宿主的固有免疫应答以及感染过程遇到的各种细胞。酿脓链球菌主要依赖自身多种毒力因子逃避宿主攻击以便于在新的体内环境存活，这些毒力因子主要包括M蛋白、DNA酶sda 1以及荚膜多糖。

当细菌侵入宿主后，宿主中性粒细胞会分泌一种由DNA、组蛋白、颗粒蛋白酶和抗菌肽组成的中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap，NET），用以清除感染的细菌。某些酿脓链球菌中含有sda1基因，其编码DNA酶并分泌到细菌外部降解NET框架，从而使酿脓链球菌逃避NET的清除杀伤作用。此外，酿脓链球菌表面的M蛋白也可以通过抑制吞噬细胞的吞噬作用帮助其免疫逃逸。还有一些强毒力的酿脓链球菌表面具有荚膜包裹，荚膜主要由透明质酸多糖组成，与宿主结缔组织中的多糖类似，因此可能利用该机制逃避宿主免疫作用。

1.4.4 细胞损伤与炎症反应

进入机体后，酿脓链球菌通过各种胞外产物和毒素使宿主产生细胞损伤和炎症反应。酿脓链球菌可以分泌两种链球菌溶血素，分别是链球菌溶血素O（streptolysin o，SLO）和链球菌溶血素S（streptolysin s，SLS）。SLO是一种依赖胆固醇的溶细胞素，它通过诱导中性粒细胞和巨噬细胞凋亡来保护细菌免受吞噬性杀伤[19-20]。SLS是一种由9个连续基因编码修饰的多肽性细胞溶素，除了溶解红细胞以外还可以损害多种细胞，如淋巴细胞、肿瘤细胞、角质细胞和白细胞等，在酿脓链球菌致病过程中发挥重要作用[21]。

链球菌致热性外毒素家族由speA、speB、speC、speJ、speH和speK基因编码，属于超抗原。它们能够刺激定植生物体的T淋巴细胞和B淋巴细胞的活性，导致强烈的免疫反应，进而使炎症因子过度释放，引起猩红热等[22]。speB基因广泛存在于酿脓链球菌中，与侵袭性和非侵袭性感染都有关系。而在酿脓链球菌菌株中检测到speA或speJ基因可能与侵袭性感染的潜在发展有关，Kittang等[23]证明了这些基因与感染侵袭性之间的关系，分离出携带这些基因的酿脓链球菌菌株的患者分别发生了以下感染：坏死性筋膜炎、中毒休克综合征、肺炎、脑膜炎和腹膜炎。

2.1 传统检测方法

目前我国食品中酿脓链球菌的传统检测方法为GB 4789.11―2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 β型溶血性链球菌检验》，标准中使用前增菌、平板分离、革兰氏染色镜检的方法，并增加了触酶试验以及生化鉴定。吴福平等[24]利用胰蛋白胨大豆肉汤TSB增菌液、哥伦比亚CNA血平板厌氧培养酿脓链球菌，发现增菌、分离效果优于葡萄糖肉浸液肉汤和普通血琼脂平板，且使用生化鉴定能有效简化实验操作，缩短检测周期。谯林等[25]采用在血平板中加入10%结晶紫的方法培养酿脓链球菌咽拭子，阳性率从2%～8.33%提高至30.7%～40.1%。

2.2 免疫学检测方法

2.2.1 酶联免疫吸附技术（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是以免疫酶技术为基础发展起来的一种新的免疫测定技术[26]，其基本原理是先将抗原或抗体与固相载体结合，当加入酶标抗体或抗原时，会经过反应形成酶标免疫复合物，用洗涤液将未反应的游离酶标抗原抗体洗掉，再加入酶底物进行显色反应，便于进行定性定量分析。王万相等[27]建立了ELISA法诊断酿脓链球菌，其检测结果与传统培养法一致且用时更短。近年来，ELISA技术的不断改进以及全自动酶标仪的发明，使其灵敏度和特异度都有了显著提高[28]。

2.2.2 免疫层析技术

免疫层析技术最早出现于20世纪80年代，1990年Beggs[29]首次报道了使用斑点层析技术检测孕妇尿液中的人绒毛膜促性腺激素，用于判定孕情。目前免疫层析技术主要分为胶体金免疫层析技术和荧光微球免疫层析技术，常见的免疫层析试纸包括4个部分：样本垫、结合垫、层析膜和吸水垫。当样品滴加到试纸条上时，会利用毛细作用在纤维膜上泳动，随后与结合垫上的特定配体结合，继续泳动直至与纤维膜上的着色标记物或酶反应，显示出颜色变化，便于肉眼观察结果。传统的胶体金免疫层析技术仅能对样品进行定性或半定量分析，相比而言，荧光微球技术便于进行定量检测，且荧光微球具有结构稳定、可重复利用等优点。李泓馨等[30]对比了胶体金法和传统培养方法检测酿脓链球菌，胶体金法的敏感度为90.5%，特异度为94.8%，证实该方法可用于儿童链球菌感染性疾病的快速诊断，但也有文献报道[31]该方法对成人酿脓链球菌咽炎的检测灵敏度和特异度高于儿童，在用于儿童的病情检测时应加以辅助手段。Vanesa等[32]采用Monte BIO Strep A®免疫层析试剂盒对儿童医院的患儿样本进行检测，得到的试剂盒敏感度为97.1%，特异度为97.8%，但是在唾液链球菌分离的血液培养样本中获得了假阳性结果，说明尽管免疫层析技术具有高特异度、敏感度，但仍需后续培养和鉴定来确认鉴定结果。

2.3 分子生物学检测方法

2.3.1 普通PCR方法

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种对特定DNA片段在体外进行快速扩增的方法，近年来，PCR作为一种快速检测病原的分子生物学方法得到了广泛的应用。目前，该技术主要运用于酿脓链球菌的spy1528、speB以及DNase B基因[33-35]。也有文献报道以荚膜多糖Cps2J基因为靶点进行序列扩增[36]。杨学明等[37]针对已公布的13株酿脓链球菌设计了7对引物，其中spyM引物具有高度特异性，检测限可达10 cfu/g样品。杜海燕等[38]针对链球菌延伸因子EF-Tu基因设计合成了一对通用引物用于链球菌的检测，其PCR扩增产物与酿脓链球菌有高度同源性。Ramalingam[39]在化脓性链球菌的种特异性标记开发过程中，发现了一条419 bp的单形条带MB，通过对试验菌株进行鉴定，证实了MB的存在，且MB与酿脓链球菌具有高度特异性，相似性达到98%，在同一属的其他物种中不存在。此外，有研究[40]报道链球菌的tuf基因（编码延伸因子Tu）可作为开发针对链球菌检测的内部探针，tuf序列数据与基于16S rRNA基因数据确定的系统发育基本一致，有望为链球菌感染的快速准确诊断提供分子诊断工具。

基于常规PCR技术建立和发展的多重PCR是一种新型PCR技术，在一对反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段。与普通PCR相比，多重PCR不仅特异性强、灵敏度高，而且更加经济便捷。Anna等[41]开发了一种方法，可以同时检测四个低容量多重PCR反应中的20种酿脓链球菌毒力因子（spd3、sdc、sdaB、sdaD、speB、spyCEP、scpA、mac、sic、speL、K、M、C、I、a、H、G、J、smeZ和ssa），且反应体系只有5 μl，试剂成本明显较低。

2.3.2 实时荧光定量PCR

荧光定量PCR技术基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号监测PCR过程，摆脱了凝胶电泳和紫外成像等步骤，因此该技术不仅具有PCR技术的高特异度和高灵敏度，还具有光谱技术的高精确定量等优点[42]。王远洋等[43]采用TaqMan探针法，针对酿脓链球菌Dnase B基因设计引物探针，对肉类中酿脓链球菌的最低检出限为23 pg/μl。

2.3.3 恒温核酸扩增技术

传统的PCR技术由于热循环的需要，必须依赖电源和PCR仪，从而限制了这一技术脱离实验室应用，为了克服这一缺点，恒温扩增技术逐渐发展起来。蔡妙森等[44]基于重组酶聚合酶等温扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）原理，选择酿脓链球菌致热外毒素B基因（speB基因）和无乳链球菌表面免疫蛋白基因（SIP基因）分别设计RPA引物和探针，该两重RPA检测体系结果准确、检测时间短、操作简单，具有较强的应用价值。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是近年来新兴的一种快速检测技术，具有灵敏度高、特异性强、耗时短和操作简便等优点。周勇等[45]将实时荧光技术与LAMP结合，建立了针对spy1258基因设计的荧光 LAMP反应体系，与传统国标法检测结果一致，但大幅缩减了检测时间。并且该体系最低检测浓度为 100 pg/μl，菌检测限低至9.8 cfu/ml，相比尹欢等[46]针对scpA基因设计的检出限为16.7 cfu/ml的LAMP体系，具有更高的灵敏度。

2.3.4 基因芯片技术与生物传感器

基因芯片又称为DNA微阵列，近年来作为一种高通量快速检测新技术逐渐兴起，其基本原理是以核酸序列杂交进行序列测定。由于基因芯片技术将大量探针固定在支持物上，所以可以同时检测和分析大量样品序列，弥补了传统核酸技术操作复杂、检测效率低的缺陷。生物传感器是一类以生物活性单元（如酶、抗体、核酸、细胞等）作为生物敏感单元，对目标测物具有高度选择性的特殊传感器，具有高度自动化、微型化与集成化的特点。Swati等[47]通过将单链DNA探针固定在金纳米枝修饰的复合电极上，开发了阻抗式mga基因特异性DNA传感器，用于快速检测风湿性心脏病患者咽拭子样本中的酿脓链球菌。经验证，该传感器对酿脓链球菌具有高度特异性，仅在30 min内就能检测到6 μl样本中低至0.01 ng的单链DNA。Natalia等[48]研究了一种新型阻抗式传感器，通过碳二亚胺化学将商用抗体修饰到金盘电极表面，检测限为9.3 cfu/ml，检测时间约为3 min。

2.4 全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）

在过去数十年，WGS方法的快速进步正在改变临床实验室将基因组学应用于生物学监测的方式，从而协助对传染病病原体的临床和公共卫生事件的处理。WGS能更好地研究菌株间的亲缘关系，用于传统流行病学具有局限性的不寻常的传播环境下公共卫生事件分析。通常认为酿脓链球菌引起的侵袭性疾病是由于接触了侵入性酿脓链球菌感染的人群或者感染但无症状的医护人员，而有研究[49]通过WGS确认2例通过相互无症状接触获得的侵入性酿脓链球菌患者的非典型点源传播情况，不仅能通过患者分离出的菌株间单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）来判断传播途径，而且可以通过比较毒力因子基因或者进一步测定转录组来判断菌株致病性。Tagini等[50]对侵袭性酿脓链球菌感染患者分离的11株酿脓链球菌进行全基因组测序，在较短时间内区分密切相关的菌株，以及查明毒力因子，包括其调节机制以及抗生素耐药性，为临床治疗提供参考。

2.5 基于蛋白质的检测方法（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption ionizer time-of- flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是一种于20世纪80年代末问世的新技术，其基本原理是依据菌体蛋白质的质谱图，与现有数据库比对，从而获得鉴定结果。MALDI-TOF-MS具有操作简便、鉴定迅速的优点，被广泛应用于临床微生物鉴定[51]。Hercules等[52]使用酿脓链球菌ATCC 700294作为实验菌株，改变鉴定过程中使用的前处理方法、基质以及菌液浓度和培养基类型，得到的MALDI-TOF-MS图谱在一组重复样本内和一段时间内都是可重复的，表明该方法具有灵敏、特异和可靠的分析酿脓链球菌的潜力。Wang等[53]评估了MALDI Biotyper 2.0用于酿脓链球菌的快速检测和聚类分析，对照生化鉴定的结果，MALDI-TOF-MS的准确率为93.85%，聚类分析中，其匹配率为67.69%。这说明，MALDI-TOFMS具有替代传统分离鉴定方法的潜力，但在分类方面还需要数据库的扩大以及MALDI-TOF-MS技术的进展来提高准确性。

酿脓链球菌在自然界中分布较广，人群携带率高，主要通过呼吸道飞沫传播。由于还未有有效的链球菌疫苗开发上市，目前对于酿脓链球菌的预防和治疗主要靠给予抗生素药物，对青霉素普遍敏感，对于青霉素过敏的患者，可使用红霉素或新的大环内酯类抗生素。

近年来，酿脓链球菌通过环境表面进行传播的方式引起了广泛关注，有研究[54]表明在干燥的环境下酿脓链球菌存活率有所提高，环境表面可能成为其传播载体，并在感染和再感染中发挥作用。手部是生活中接触物品较多的部位，做好手部卫生有利于阻断病菌传播途径，有研究[55]表明经聚六亚甲基双胍盐酸盐（PHMB）处理的非无菌医用手套对接触表面的酿脓性链球菌有较好的抑制效果，可应用于医院等特殊场所。对于日常手部清洁，洗手液是较好选择，目前市面上宣称对酿脓链球菌有抑制作用的洗手液较少，开发对酿脓链球菌有良好杀菌效果的绿色环保型抗抑菌洗手液具有较好的实用价值和广阔的市场前景。此外，洗手液在生产和使用过程中，也可能受酿脓链球菌污染而成为传播载体，因此建立适用于日化行业的酿脓链球菌快速检测技术对于洗手液的质量控制具有重要意义。

酿脓链球菌广泛存在于自然界中，能分泌多种毒力因子，致病机制较为复杂，是人类健康的一大威胁。近年来，酿脓链球菌的检测技术已从传统的分离培养方法发展到免疫学方法检测及核酸分子方法检测，毫无疑问，高通量、高特异性的检测方法是未来的发展趋势。高效的检测方法不仅有利于菌株感染的快速鉴定和及时提供治疗方案，还有利于相关食品、日化产品的快速、安全流通。本文通过研究酿脓链球菌生物学特性及检测方法，为寻找新的酿脓链球菌检测靶点、开发用于预防酿脓链球菌感染的日化产品提供理论基础和思路。

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