具核梭杆菌促进结直肠癌发生发展机制的研究进展

罗婉逸 韩居熺 周学东,2 彭显,2 郑欣,2

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医学院 成都 610041；
2.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科 成都 610041

具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，F.nucleatum）是革兰阴性厌氧菌，广泛定植于人体口腔和肠道等器官，与牙周病的发生发展有着密切的关系[1-2]。作为一种机会致病菌，F.nucleatum还被发现与全身系统性疾病相关，如心血管疾病[3]、骨关节炎[4]、妊娠不良事件[5]及各系统肿瘤[6-9]等。近年来，F.nucleatum被发现与结直肠癌（colorectal cancer）的生物学行为改变有直接的密切关系，二者的关系得到了广泛的研究。本文就F.nucleatum黏附、定植、迁移以及对结直肠癌的影响与作用机制进行综述，为进一步研究F. nucleatum与结直肠癌之间的相互作用提供依据。

目前流行病学的研究结果并不支持牙周炎与结直肠癌之间有明确的关联性[10]。Michaud等[11]通过随访调查发现：在排除已知风险因素（包括吸烟史和饮食因素）的影响后，患结直肠癌风险与自我报告的牙周炎（风险比为1.05，95%置信区间为0.90~1.23）或牙齿缺失（风险比为1.10，95%置信区间为0.87~1.37）并没有显著联系。在一项针对日本成年人的病例对照研究[12]中，研究者采用牙齿脱落数量作为牙周炎的代替指标，结果发现：与余留牙齿在21颗以上的群体相比，不同程度的牙齿缺失（剩余0、1~8和9~20 颗牙齿）和患结直肠癌风险之间没有显著关联。Ren等[13]进行了一项嵌套病例对照研究，该研究基于3个队列，在分析结果时将其中2个中国队列合并，为上海男性和上海女性（病例组n=825，对照组n=3 298），第3个是美国南方社区队列（病例组n=238，对照组n=2 258）。在上海男性/上海女性或美国南方社区队列研究中，结果均发现不同的牙齿脱落数量与结直肠癌风险之间没有关联。还有研究[14-15]将患者自我报告作为牙周炎的代替指标，结果发现在绝经期妇女[14]和从不吸烟[15]的妇女中，牙周炎和患结直肠癌的风险没有相关性。

结直肠癌患者病灶处的F.nucleatum与口腔中的具有同源性。Komiya等[16]通过随机引物聚合酶链式反应（arbitrarily primed-polymerase chain reaction，AP-PCR）技术比对了结直肠癌患者肿瘤病灶处与唾液中的F. nucleatum，结果发现：超过40%的患者结直肠癌肿瘤处与口腔中具有相同的F.nucleatum菌株，提示肠道F.nucleatum主要起源于口腔。F.nucleatum在何种情况下可以从口腔位移到结直肠并对结直肠癌的进展产生影响？Kitamoto等[17]的研究发现：口腔病原菌只有在同时满足肠道炎症及牙周炎症两个状态时，才能在肠道异位定植，并进一步通过炎症因子白细胞介素（interleukin，IL）-1β及致病性T细胞加剧肠道炎症，肠道炎症的加剧会导致结直肠癌发生风险的增加，促进炎症向结直肠癌的转变[18-20]。肠道炎症状态下的肠道菌群缺乏定植抗性，同时牙周炎增加了口腔病原体的丰度并增加了口腔病原体成功通过胃中酸性环境的可能性，使得摄入的病原体达到一定的阈值，得以在肠道成功定植。由此可见，单纯患有牙周炎的患者，肠道菌群存在定植抗性，口腔来源的病原菌难以异位定植；
而对于本身存在肠道炎症这一状态的患者而言，牙周炎或许会成为一个促进炎症向癌症转变的风险因素。

基于以上研究结果，F.nucleatum需要从口腔迁移到肠道才能进一步发挥作用，而F.nucleatum的迁移机制尚未完全明晰。目前学者们[21-23]提出了具有较高可能性的两条途径：一是自口腔通过消化道到达肠道[22]；
二是从口腔进入血液，通过循环系统到达肠道[23]。目前已有大量相关的动物实验及临床研究用于佐证以上两个观点。

2.1 通过消化道迁移

临床研究[24-26]发现：在结直肠癌患者中，F.nucleatum在肿瘤病灶中的检出率从直肠（2%）向盲肠（11%）逐渐富集，所有子位点之间呈线性上升（P<0.000 1），肿瘤位置靠近上端的结直肠癌患者中F. nucleatum丰度较高，盲肠癌的F. nucleatum检出率最高。基于这些研究结果，Nakajima等[22]提出了F.nucleatum可自口腔吞入，经过消化道（食管、胃、小肠）到达结直肠，并通过特定的黏附机制定植于肿瘤病灶处的观点。在Apc-Min/+小鼠模型中，经口饲喂F.nucleatum可以促进小鼠结直肠肿瘤的发展，提示F.nucleatum是从口腔进入胃肠道[27]。

F.nucleatum作为口腔常见的条件致病菌，是长期存在于正常人体的革兰阴性杆菌，可伴随摄食饮水等日常活动进入胃肠道。除此以外，F.nucleatum还可随分泌的唾液进入消化道下段。健康成人1 d分泌的唾液量为0.5~1.5 L[28]，通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对健康成人唾液中的F.nucleatum进行定量，数量可达（6.35±0.78） log10copies·mL-1，在结直肠癌患者体内更是高达 （6.89±1.07） log10copies·mL-1[29]，每天均有大量的F. nucleatum持续地被吞入胃中。F.nucleatum进入胃内后，胃酸会对不能抵抗酸性环境的细菌起到杀灭作用[30]。虽然F. nucleatum的抗酸机制还未得到具体阐明，但在动物实验[31-32]中，无菌小鼠体内F.nucleatum具有克服小鼠胃内物理屏障，定植到肠道内的能力。研究[32]表明：F.nucleatum可在无菌小鼠的肠道内定植并占据优势，但在接种肠道菌群后，F.nucleatum丰度显著下降；
健康个体的肠道菌群对F.nucleatum有显著的抵抗作用，F.nucleatum难以突破微生物屏障。但在结直肠癌患者体内，肠道菌群发生改变[33]，有助于维持肠道生态稳定的有益菌数量减少[34]，可引起炎症或代谢性疾病的条件致病菌增多，微生物屏障的抵抗作用减弱，F.nucleatum得以成功定植。

2.2 通过血液循环系统迁移

除了消化道迁移外，血液循环是另一种口腔细菌定植肠道的途径[35]。研究[35]发现，采取尾静脉注射的方式向小鼠给予F. nucleatum，发现F. nucleatum大量定植于小鼠结直肠肿瘤组织处，且肿瘤组织中F. nucleatum的丰度明显高于邻近正常组织。

所有的日常活动，包括刷牙、咀嚼、吞咽等都有可能导致F.nucleatum从龈沟或口腔内的细小伤口进入血液[36-37]。牙周炎发生时，F.nucleatum数量显著增加，牙周炎患者刷牙后15 min，血液中的细菌密度可达每毫升104个，同时牙龈内血管因炎症扩张，大量F.nucleatum得以进入人体血液循环[35,38]。除此之外，F. nucleatum可通过黏附素FadA与血管内皮细胞钙黏连蛋白（VE-cadherin）结合，破坏血管内皮细胞之间的细胞结合，使得血管通透性增加，F.nucleatum得以通过疏松的细胞间连接进入血管内，进而通过血液循环到达全身各处组织中[39]。

进入血液循环后，F.nucleatum面临着宿主免疫系统的威胁，为逃避宿主体内免疫系统的吞噬作用，细菌会入侵并寄生于宿主细胞内[40]。F.nucleatum是一种兼性胞内寄生菌，可入侵宿主的巨噬细胞，并通过表达吲哚胺2,3-二氧化酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）抑制外周淋巴细胞活性，使得被感染的巨噬细胞免于被清除[41]。

F.nucleatum到达肠道后，在肿瘤病灶处富集，正常肠黏膜处F. nucleatum的丰度明显低于病灶处[42]。F. nucleatum在肿瘤病灶处高度聚集的可能原因有两个：一是F.nucleatum与结直肠癌细胞之间存在特异性结合，二是F.nucleatum对肿瘤内部的微环境有较强的适应能力。

3.1 F.nucleatum与结直肠癌细胞的特异性结合

Rubinstein等[43]通过共免疫沉淀检测方法检测到，结直肠癌病灶处，F.nucleatum表面的黏附素FadA可以与结直肠癌表面的上皮细胞钙黏蛋白E-cadherin特异性结合，介导F. nucleatum黏附侵袭。黏附素FadA是F.nucleatum的一种毒力因子，起到黏附侵袭上皮细胞的作用。E-cadherin是一类钙依赖的细胞黏附糖蛋白，每个蛋白由5个胞外重复结构域（EC1—EC5）、一个跨膜结构域及一个结合p120连环素和β-连环素的胞内结构域组成。FadA与E-cadherin的结构域EC3结合，进一步通过激活E-cadherin介导的信号通路促进肿瘤的发生发展。糖类肿瘤标记物gal-GalNac作为结直肠癌的生物标记物，在结直肠癌细胞表面大量表达，可被F.nucleatum表面的黏附素Fap2识别，并在特异性结合后完成定植。在小鼠结直肠癌模型中，相比于野生型的F.nucleatum，天然缺乏Fap2的菌株或灭活Fap2的突变株与表达gal-GalNAc的结直肠癌细胞结合率明显下降，再次证明Fap2可介导F. nucleatum与 gal-GalNAc结合[23]。

3.2 F.nucleatum对肿瘤内部微环境的适应能力

为了满足肿瘤快速发展的需求，肿瘤采用了与人体普通细胞不同的代谢机制。这种特殊的代谢方式导致肿瘤内部微环境呈酸性，乏氧，和/或缺乏免疫细胞所需关键营养物质的状态[32]。无氧环境中，F.nucleatum具有相对较高的活性与繁殖力，同时缺乏免疫细胞的环境使得F.nucleatum的数量得以迅速增加，使F.nucleatum定植并快速繁殖[44-45]。结直肠癌细胞摄入葡萄糖能力较强，肿瘤微环境中乏糖，F.nucleatum可利用葡萄糖以外的碳源作为营养来源，F.nucleatum可以通过氨基酸的发酵获得能量，对肿瘤微环境有较强的适应能力[46-47]。F.nucleatum通过作用于调控糖酵解的关键酶alpha-Enolase的长链非编码RNA（long non-coding RNA enolase1-intronic transcript 1， lncRNA ENO1-IT1）促进结直肠癌进行糖酵解，进一步促进肿瘤的生长[48]。F.nucleatum通过上调转录因子SP1（specific protein 1）与lncRNA ENO1-IT1启动子区域的结合率来激活lncRNA ENO1-IT1的转录。升高的ENO1-IT1作为组蛋白乙酰转移酶的编码基因 （lysine acetyltransferase 7，KAT7） 的导向模块，指定其靶基因（包括ENO1）上的组蛋白修饰模式，改变结直肠癌的生物学功能。本课题组[49]研究发现：F.nucleatum通过促进组蛋白乙酰化修饰来上调人血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like 4，ANGPTL4）表达，进而促进结直肠癌细胞摄入葡萄糖及增强糖酵解水平。F.nucleatum在肿瘤组织内的定植与生存依赖于肿瘤细胞高水平的糖酵解活性，提示两者可在肿瘤微环境中形成互利共生关系。

4.1 促进肿瘤细胞生长

研究[40,43,50]表明：F. nucleatum表达的黏附素FadA与结直肠癌细胞的E-cadherin特异性结合后可通过多种机制激活并上调Wnt/β-catenin信号调节通路，促进肿瘤细胞的生长。Rubinstein等[50]发现：通过FadA与结直肠癌细胞的E-cadherin特异性结合，F.nucleatum能促进表达E-cadherin的结直肠癌细胞的增殖，但对不表达E-cadherin的结直肠癌细胞无明显促进作用。E-cadherin是一种通过β-链蛋白（β-catenin）发挥作用的肿瘤抑制因子[51-52]，正常情况下可抑制F.nucleatum导致的肿瘤生长与炎症反应，但FadA与E-cadherin结合后，激活了Wnt/β-catenin信号通路，导致原癌基因过表达，上调相应蛋白G1/S-特异性周期蛋白-D1的编码Cyclin D1的过表达，促进结直肠癌细胞的生长。除此之外，FadA与E-cadherin结合后，还可以上调信号蛋白ANXA1（Annexin A1） 的表达。在Rubinstein等[50]的研究中发现：Annexin A1 是一种Wnt/βcatenin信号调节器，在肿瘤细胞中特异性表达，是Wnt/β-catenin信号通路激活所必需的。同时，FadA与Annexin A1阳性的癌细胞之间存在正反馈循环，可以促进癌细胞迅速增殖。

F.nucleatum可通过RAS蛋白/丝裂原活化蛋白激酶通路（Ras-Raf-MEK-ERK mitogen activated protein kinase，RAS/MAPK）促进肿瘤细胞生长。F.nucleatum表 面 的 脂 多 糖 （lipopolysaccharide，LPS）与结直肠癌细胞表面的Toll样受体4（Tolllike receptor 4，TLR4）受体结合，激活TLR4与髓样分化因子 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）结合，使信号向下游转导，进而激活核因子-κB （nuclear factor kappa B，NF-κB），上调非编码单链RNA的表达。非编码单链RNA可以通过影响肿瘤组织中T细胞与髓样细胞的浸润，上调肿 瘤 坏 死 因 子 -α （tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、IL-6、IL-17A、IL-21等因子在组织中的表达，影响上皮细胞增殖[53]。同时在过度表达miR21的细胞中，RASA1持续下调。RASA1作为RAS功能的抑制因子，增强RAS蛋白内在微弱的G蛋白活性，使得RAS 进入失活的二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate，GDP）结合态，从而抑制细胞增殖和分化。随着RASA1表达的下调，结直肠癌细胞的增殖逐渐失去控制[54]。

4.2 抗化学治疗作用

临床研究[55]发现：病灶处F.nucleatum丰度高的结直肠癌患者往往预后不佳，且化学治疗（简称化疗）后肿瘤复发的结直肠癌患者肿瘤样本中丰度明显高于未复发者，由此可见F.nucleatum可增强结直肠癌的化疗耐药性。Yu等[56]发现：F.nucleatum通过表面LPS与TLR4结合，激活TLR4，使之与髓样分化因子MyD88结合并激活信号通路NF-κB，下调细胞内miRNA-18a*（*示表达水平较低）和miRNA-4802的表达，使得自噬相关元件ULK1 蛋白 （unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1） 和ATG7蛋白 （autophagy related 7，ATG7）的表达上调，进而启动自噬，而自噬作为一种保护机制可以起到对化疗药物（5-氟尿嘧啶和奥沙利铂）的抵抗作用。此外，通过信号通路NF-κB，还可以通过上调自噬相关基因BIRC3（baculoviral IAP repeat containing 3）的表达来降低结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[57-59]。

4.3 促进肿瘤转移

据统计，伴有远端转移的结直肠癌患者5年生存率不足10%[60]，但结直肠癌发生转移的机制尚未完全明晰。Li等[61]通过对101个结直肠癌患者的肿瘤组织与癌旁正常组织进行检测，发现淋巴结转移组的患者F.nucleatum丰度明显高于未转移组，提示F.nucleatum的感染与肿瘤的发展和转移有关。

F.nucleatum感染结直肠癌细胞通过激活NF-κB通路上调蛋白KRT7-as （keratin7-antisense）/角蛋白KRT7（keratin7）的表达，促进结直肠癌细胞体外转移和体内肺转移。在清除KRT7-as后，F.nucleatum导致的结直肠癌体内肺转移受到抑制[62]。KRT7-as上调KRT7的表达，KRT7属于Ⅱ型细胞角蛋白，是细胞骨架和上皮中间丝的组成部分，还可以促进细胞运动[63-65]。临床研究发现：KRT7在有淋巴结转移的患者体内表达更活跃，且高丰度的F.nucleatum与更高的肿瘤出芽分级程度明显相关[66-67]。通过NF-κB通路，F.nucleatum还可以上调CARD3（caspase activation and recruitment domain 3）蛋白的表达，促进自噬，增加体内外的上皮间充质转换，促进结直肠癌的转移[68]。

F.nucleatum通过影响结直肠癌细胞的外泌体来促进转移的发生。肿瘤细胞释放的外泌体由特定的RNA和蛋白质载体组成，在促进肿瘤进展的过程中起到重要的调节作用[69]。被F.nucleatum感染后的结直肠癌细胞会释放富含miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16/RhoA/IL-8的外泌体，外泌体miR-1246/92b-3p/27a-3p通过与糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）β靶向结合和激活Wnt/β-catenin通路促进结直肠癌细胞迁移[70]。

F.nucleatum在肿瘤细胞中的定植，在远端转移处依旧维持，即在远端转移的肿瘤细胞中也发现了F.nucleatum的感染，证明了原发性肿瘤和与之配对的转移灶的微生物组具有稳定性。随结直肠癌到达转移灶的F.nucleatum还可以进一步促进转移灶的增殖与分化[62,68,71]。

4.4 调控肿瘤免疫微环境

Kostic等[27]发现：F.nucleatum感染在ApcMin/+小鼠模型（一种小鼠自发性结直肠癌癌前病变模型）中，通过选择性地招募浸润肿瘤的髓系细胞，产生了有利于结直肠癌进展的促炎微环境。骨髓来源抑制性细胞是一类免疫抑制细胞，已被证实能抑制T细胞的功能，促进肿瘤的生长[72-73]。Gur等[74]发现：在F.nucleatum存在的条件下，自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）对各种肿瘤的杀伤作用可以被抑制。免疫抑制性受体TIGIT（T cell immunoglobulin and ITIM domain） 是一种存在于所有人类NK细胞和各种T细胞上的抑制受体，F.nucleatum表面的Fap2蛋白可直接与TIGIT相互作用，从而抑制NK细胞的细胞杀伤能力。肿瘤浸润淋巴细胞同样表达TIGIT，同样F.nucleatum可通过Fap2抑制T细胞活性。F.nucleatum通过TLR4依赖性机制促进肿瘤微环境中巨噬细胞的M2极化[75]。癌症微环境中的巨噬细胞可分化为M1 表型（阻碍肿瘤进展）或M2 表型，M2极化的巨噬细胞可增强肿瘤细胞增殖、迁移、血管生成和转移的能力[76-77]。F.nucleatum感染可能以TLR4依赖性方式激活巨噬细胞中的IL-6/p-STAT3/c-MYC 信号通路，从而控制巨噬细胞向M2型分化[78]。

结直肠癌作为全球发病率第二的消化道肿瘤，F.nucleatum在其中起到的作用一直受到广泛的关注。随着人们对F.nucleatum在结直肠癌中可能机制的研究，F.nucleatum逐渐成为诊治结直肠癌及预后评估的研究重点。F.nucleatum可激活多个信号通路来调节机体肿瘤基因表达、蛋白分泌水平、免疫功能，在结直肠癌发生发展的各个阶段起到促进作用。高丰度的F.nucleatum不仅可以促进肿瘤细胞的生长分裂，还可以降低肿瘤细胞的敏感性，促进远端转移以及调控免疫环境，因此F.nucleatum不仅可以作为靶点治疗结直肠癌，还可以用于肿瘤的预后评估。F.nucleatum与结直肠癌之间的相互作用有深入研究的价值，值得更进一步的探索。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。

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