曲美他嗪对心肌缺血再灌注损伤大鼠钙蛋白酶的调控及其对细胞凋亡的作用机制Δ
时间：2023-04-08 10:00:07 来源：千叶帆 本文已影响人
何文凤，薛 成，郑健康，帅 壮，岳荣川
(川北医学院附属医院心内科心血管疾病实验室，四川 南充 637000)
心肌梗死是导致心血管疾病人群死亡的主要原因，冠状动脉介入治疗和动脉旁路植入术等是目前临床治疗该类患者的主要措施，上述手术治疗措施虽可在短时间内快速开通患者的闭塞血管，但也会明显增加患者发生心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)的风险[1-2]。目前，关于MIRI的具体发生机制尚未完全明确，多数研究结果认为钙离子超载、血管内皮细胞损伤、炎症反应、细胞自噬和细胞凋亡等因素与MIRI的发生密切相关[3]。分子心血管病学研究结果已证实，细胞凋亡是心肌细胞损伤的主要形式，而此过程的发生与多种基因的调控作用密切相关[4-5]。钙蛋白酶(Calpain)是一种普遍存在于哺乳动物细胞内的钙依赖的蛋白酶，当心肌缺血/再灌注(I/R)发生时，细胞内Calpain会被异常激活，进而促使凋亡物质大量释放，加重心肌细胞损伤[6-7]。卢圣忠[8]的研究结果发现，Calpain对小鼠心肌细胞凋亡和心肌功能障碍的发生具有明显的促进作用，而抑制Calpain活性则可起到减轻I/R损伤的效果。大量临床证据已证实，曲美他嗪对MIRI具有明确的治疗效果，但其具体改善机制尚不明确。本研究推测曲美他嗪可能是通过调控Calpain和细胞焦亡过程来起到减轻心肌损伤的作用，现报告如下。
1.1 材料
1.1.1 实验动物：雄性SD大鼠30只，SPF级，体重200～250 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供[合格证号：SCXK(京) 2016_0008]。
1.1.2 仪器：DY89-11型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；
VCX130PB型超声波细胞破碎仪(美国Sonics公司)；
ES315型自动蒸气消毒柜(日本Tomy公司)；
VS-1300L-U型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；
CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)；
80-2型低速台式离心机(上海百典仪器设备有限公司)；
Infinite M200型多功能酶标仪(瑞士TECAN公司)；
LSM 780型高灵敏度激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)；
荧光分光光度计(美国Cary Eclipse VARIAN公司)；
电子天平(德国Sartorius公司)；
显微外科器械(宁波市成和显微器械厂)；
日立7060型全自动生化分析仪(日本Hitachi公司)。
1.1.3 药品与试剂：盐酸曲美他嗪缓释片[施维雅(天津)制药有限公司，国药准字H20100077，规格：35 mg]，用蒸馏水配置为30 mg/L的混悬液备用。大鼠肌酸激酶(CK)测定试剂盒 (苏州科铭生物技术有限公司，批号：20200629)；
大鼠乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20200629)；
无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS，武汉博士德生物工程有限公司，批号：16A20B21)；
DNA原位末端标记(TUNEL)凋亡检测试剂盒(上海金畔生物科技有限公司，货号：22849)；
Caspase-1活性检测试剂盒(美国Biomol公司，货号：KLPR2107)；
白细胞介素(IL)1β检测试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司，货号：FN-EM1624)；
核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)抗体、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)抗体(美国Abcam公司，货号：KLPR2107、2257223)。
1.2 方法
1.2.1 动物的喂养：在室内自然照明条件下对大鼠进行7 d适应性喂养，实验前后的动物喂养条件保持一致，本研究过程中对实验动物的处理均严格遵守动物伦理学中的相关规定。
1.2.2 动物分组和造模：将30只大鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组和曲美他嗪干预组。Sham组大鼠仅置缝线，不对冠状动脉进行结扎。模型组和曲美他嗪干预组均采用手术结扎大鼠心肌冠状动脉左前降支(LAD)的方法进行造模，具体如下，采用戊巴比妥对大鼠进行麻醉，而后将其以仰卧位固定于操作台之上，并以加热等进行照射，确保直肠温度始终处于36.5～37.5 ℃。气管插管后，以小型啮齿动物呼吸机进行通气，呼吸频率为75次/min，呼吸比为1∶ 1，潮气量为20 mL；
以左胸阔为手术切口，打开胸腔，于胸骨左边缘2 mm处和第二、第三肋骨点之间进行纵向切口，并将心包切开，使心脏外露；
使用8/0尼龙线穿过LAD近端部分下方的心肌，LAD系活结，并外露结扎末端；
LAD闭塞30 min，打开活结恢复血流2 h，而后使用捆扎前放置好的缝合线将大鼠胸部缝合。采用心电图对造模大鼠进行实时监测，若心电图ST段抬高≥0.3 mV或T波迅速升高、局部心肌出现紫绀表示存在心肌缺血；
心电图ST段降低或T波恢复至正常水平、心肌缺血区转红则表示MIRI模型造模成功。
1.2.3 给药方法：待造模完成进行给药，三组大鼠灌胃剂量根据成人每日常规用药剂量，按动物体表面积换算成大鼠日等效剂量。曲美他嗪干预组大鼠每日给药剂量为20 mg/kg，Sham组、模型组大鼠则应用相同剂量的0.9%氯化钠溶液进行灌胃处理，1日1次，持续1周。
1.2.4 取材：(1)大鼠血清。待再灌注结束时，采集大鼠腹主动脉血液，并于4 ℃条件下以4 000 r/min进行离心，10 min后，留取上清液并置于-80 ℃环境中待统一检测。(2)大鼠心肌组织。除伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑法(TTC法)染色的大鼠心脏外，其他大鼠均在收集血清样本后立即处死，切除心脏并以冷盐水进行充分洗涤后，在保持于4%多聚甲醇中备用。
1.2.5 苏木精-伊红(HE)染色：将经4%多聚甲醛固定24 h的心尖部组织进行石蜡包埋处理后，制成5 μm切片，并以二甲苯、100%乙醇、75%乙醇梯度进行脱水处理后，以蒸馏水充分洗净；
经苏木精染色、自来水清洗、盐酸乙醇分化处理后，浸泡于自来水中，加入伊红液，经95%乙醇、100%乙醇、二甲苯依次处理后，以中性树胶进行封固，并于显微镜下观察组织情况。
1.2.6 心肌梗死面积估算：采用伊文思蓝和TTC双染色法确定大鼠心肌梗死和缺血区域。首先将切片置于1% TTC溶液中，并于37 ℃条件下进行孵育，时间为15 min。判断标准：非梗死区呈红色，梗死区不染色。使用数码相机拍摄照片，并通过专业图像分析软件(Sigma ScanPro v4.0，美国Ashburn公司)对心肌梗死面积的比例进行计算。梗死区域为心肌中未被TTC染色的灰白区域；
非梗死心肌呈红色，红色和灰白色交界处为缺血区。以缺血区与左心室(LV)的百分比表示梗死危险区，以梗死区域占缺血区的百分比表示心肌梗死面积。
1.2.7 心肌酶检测：取部分备用血清样本，经解冻处理后，采用速率法检测血清CK和LDH水平。
1.2.8 心肌细胞凋亡检测：采用TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡情况，取备用心肌组织，经常规脱蜡水化处理后，滴加20 μg/mL蛋白酶k，于37 ℃环境中孵育15 min，以PBS溶液冲洗3次后(每次5 min)，使用0.3%H2O2进行封闭处理，37 ℃孵育15 min，而后按照标记液与酶浓缩液9∶ 1的比例配制TUNEL反应液(冰上操作)。制备完毕后，将组织切片放入湿盒，滴加TUNEL反应液，37 ℃避光孵育1.5 h。PBS溶液再次冲洗，每次5 min，冲洗3次；
滴加适量Hoechst 33342染色液，室温(25 ℃)、避光条件下孵育5 min，再次使用PBS进行冲洗，共3次，每次5 min；
最后置于室温条件下风干组织切片，用抗荧光淬灭封片液封片，在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。
1.2.9 Calpain活性检测：SUC-LLVY-AMC作为荧光底物，通过检测其降解产物AMC的量以评估Calpain活性。取部分心肌组织制备150 μL心肌匀浆液，加入1 mL反应缓冲液，并置于37 ℃恒温水浴箱中进行振荡，10 min后再加入150 μL N-Scuccinyl-Leu-Tyr-AMC(500 μmol/L)，继续振荡1 h。取1 mL加入比色皿中，使用荧光分光光度计进行检测，波长设定为360 nm，测定440 nm处发射的荧光强度。以已知浓度的AMC制定标准曲线，以“ngAMC/min·(mg蛋白)”表示检测结果。
1.3 统计学方法
2.1 各组大鼠心肌细胞HE染色结果
Sham组大鼠心肌细胞核清晰可辨，心肌纤维整齐排列，胞浆均匀着色；
模型组大鼠心肌细胞核浓缩，心肌纤维排列混乱，细胞变性呈空泡状，且可伴有炎症细胞浸润；
曲美他嗪干预组大鼠心肌细胞间质轻度水肿，心肌纤维排列正常，见图1。
2.2 各组大鼠心肌损伤程度比较
Sham组大鼠未发生心肌梗死；
曲美他嗪干预组大鼠心肌梗死面积为(13.53±4.18)%，较模型组的(25.87±6.85)%显著缩小，差异有统计学意义(P<0.05)；
模型组和曲美他嗪干预组大鼠心肌酶CK、LDH水平明显高于Sham组，其中曲美他嗪干预组各项心肌酶指标水平均低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示曲美他嗪干预可明显减轻I/R损伤，见图2—3。
A.模型组；
B.曲美他嗪干预组
与Sham组对比，*P<0.05；
与模型组对比，#P<0.05
2.3 曲美他嗪对I/R心肌细胞凋亡的影响
Sham组中可见少量心肌细胞凋亡；
模型组中心肌细胞呈弥漫分布，凋亡数量明显增多；
经曲美他嗪干预后，心肌细胞凋亡明显减少，见图4。模型组Caspase-3蛋白表达水平较Sham组明显升高，Bal-2蛋白水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；
与模型组相比，曲美他嗪干预组Caspase-3蛋白表达水平偏低，Bal-2蛋白表达水平较高，差异均有统计学意义(P<0.05)；
曲美他嗪干预组与Sham组Caspase-3、Bal-2蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示曲美他嗪可抑制I/R心肌细胞的凋亡，起到保护作用，见表1。
A.Sham组；
B.模型组；
C.曲美他嗪干预组
表1 各组大鼠Bcl-2、Caspase-3蛋白表达灰度值比较
2.4 各组大鼠I/R心肌细胞Calpain活性比较
模型组大鼠I/R心肌细胞Calpain活性明显高于Sham组和曲美他嗪干预组，差异均有统计学意义(P<0.05)；
Sham组与曲美他嗪干预组大鼠I/R心肌细胞Calpain活性的差异无统计学意义(P>0.05)，提示曲美他嗪对IR心肌细胞的Calpain活性具有明显的抑制作用，见图5。
与Sham组对比，*P<0.05；
与模型组对比，#P<0.05
多数学者认为，心肌细胞凋亡与MIRI的发生存在着密切联系，心肌细胞凋亡可加速心脏结构重构，并对心肌梗死面积也有着一定的影响，而MIRI的发生也会导致心肌细胞凋亡的发生[9-10]。有报道指出，再灌注可有效阻止心肌坏死的进一步加剧，但无法阻止已坏死的心肌细胞发生凋亡[11]。曲美他嗪是欧洲心脏学会专家组推荐使用的抗心绞痛类药物，可有效维护细胞内环境稳定，维持细胞在缺氧缺血状态下的能量代谢，对MIRI所致的心肌损伤具有明确改善效果[12-13]。
由于SD大鼠的遗传基因与人体的相似率较高，且LAD是大鼠左心主要的供血管，故本研究以SD大鼠为研究对象，并通过对其LAD进行结扎构建MIRI模型。本研究结果显示，模型组大鼠心肌细胞发生明显改变，且伴有炎症细胞浸润；
而曲美他嗪干预组大鼠心肌纤维排列无明显异常，仅细胞间质发生轻度水肿，且曲美他嗪干预组大鼠心肌梗死面积明显小于模型组，其心肌酶CK、LDH水平低于模型组。这表明曲美他嗪可明显减轻心肌细胞损伤。当MIRI发生时，可导致细胞膜通透性增加，继而导致心肌胞浆中的酶类大量释放进入血液，其含量的改变可间接反映心肌细胞的损伤程度，尤其是CK、LDH这2种特异性酶，现已成为临床评估心肌损伤程度和心肌梗死范围的定量指标[14]。此外，Bal-2、Caspase-3蛋白均与细胞凋亡密切相关，其中Bal-2被称为抗凋亡蛋白，对多种因素所致的细胞凋亡具有明显的抑制作用[15]；
Caspase-3可促进细胞凋亡[16]。本研究结果显示，曲美他嗪干预组细胞凋亡较模型组明显减少，Caspase-3蛋白表达水平较模型组明显降低，Bal-2蛋白表达水平较模型组显著升高，表明曲美他嗪治疗可有效减少心肌细胞凋亡。由此可见，曲美他嗪对MIRI的临床疗效确切，与既往研究结论相符。
Calpain在人体的多种生理病理过程中起着重要作用[17-18]。研究结果显示，抑制Calpain活性可对小鼠心脏I/R损伤起到细胞保护作用[19]。也有研究结果发现，在Calpain转基因小鼠的心肌细胞中，NLRP3炎症小体被活化，进而导致心功能不全的发生，提示Calpain的表达与心肌细胞焦亡存在一定的联系[20]。卢圣忠[8]也得出了类似的结论，即Calpain过表达会进一步加重心肌细胞损伤，但值得注意的是，Calpain对焦亡通路起到单向激活的作用，但不受NLRP3/ASC、Caspase-1通路的反馈调节。本研究结果显示，模型组大鼠I/R心肌细胞Calpain活性明显高于Sham组和曲美他嗪干预组，表明MIRI的发生可导致Calpain活性增强。而Sham组与曲美他嗪干预组大鼠I/R心肌细胞Calpain活性的差异无统计学意义(P>0.05)，表明曲美他嗪对Calpain的活性具有明显的抑制作用。
综上所述，曲美他嗪可通过抑制Calpain活性来抑制心肌细胞凋亡和焦亡，从而起到心肌损伤的作用。本研究还存在不足之处，未能明确曲美他嗪治疗MIRI的最佳剂量，且本研究仅为动物实验，仍需进一步研究深入探讨。
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