血管性血友病的研究进展

高洪臣，丘木水 综述，于晓洁△ 审校

吉林大学第一医院：1.检验科；
2.心脏外科，吉林长春 130021

血管性血友病(vWD)是临床上一种常见的出血性疾病，可分为先天性和获得性,最初由ERIKVON WILLEBRAND 在 1926 年描述。先天性vWD的发病机制是患者的血管性血友病因子(vWF)基因突变，导致血浆vWF数量减少或质量异常[1]。获得性vWD是指无自幼出血和家族性出血病史，但由于各种获得性因素如产生vWF自身抗体或vWF清除过多等导致血浆vWF数量减少或质量降低所引起的获得性出血性疾病。由于vWD的类型不同，出血等临床症状差异较大，而实验室检查较为复杂，通常要结合病史与临床症状进行综合判断。本文对vWD的发病机制、诊断及治疗等方面进行详细回顾性总结，以期临床医生能进一步认识该疾病，从而指导临床。

vWF是一种在内皮细胞和巨核细胞中产生的大型多聚体血浆糖蛋白。从12号染色体转录的vWF的初始合成发生在内皮细胞和巨核细胞中，作为重复结构域序列的2 813个氨基酸的前多肽前体，前 22个氨基作为信号肽启动翻译后加工，然后将信号肽切割，使前肽单体二聚化[2]。vWF富含半胱氨酸，一种中性但极性的氨基酸，以促进其高级结构所必需的多聚化和二硫键桥接。多聚化可以组合不同数量的前vWF亚基，从而产生多聚体的异质混合，包含2～60 个甚至更多的前vWF亚基；
翻译后糖基化、唾液酸化、硫酸化和折叠发生在内质网和高尔基体中；
组装后，对校准前vWF二聚体至关重要的前肽结构域(D1～D2，741个氨基酸)被切割成成熟的含2 050个氨基酸的vWF。一旦合成，vWF 被运输以储存在巨核细胞和血小板的α颗粒中，并被包装到内皮细胞内的Weibel-Palade小体中。此外，体外实验还证实了vWF多聚体通过肝脾巨噬细胞在循环中清除，该过程与多聚体的大小无关[3]，而与巨噬细胞的低密度脂蛋白(LDL)相关蛋白质和剪切力有关[4]。

vWF分子包含A1、A3、C1和D 4个不同功能的亚单位，通过与不同物质结合发挥相应的生物学作用(表1)。而vWD的发病机制也因是否为遗传性(图1)或者获得性而有所不同。其中遗传性vWD主要发病机制是vWF基因突变，进行vWF基因检测有助于vWD的分型及鉴别诊断。与所有检测一样，基因检测并非没有缺陷，即使在健康人群中，vWF基因也存在相当大的变异性[5]。相对的，获得性vWD的发病机制无非是各种获得性因素引起vWF质量或数量的减少(表2)，最终导致相应的临床症状。

图1 vWD的发病机制

表1 vWF分子亚单位的生物学作用

表2 获得性vWD发病机制

vWF首先通过在血管损伤部位与暴露的内皮下基质(主要是胶原蛋白)结合；
其次通过血小板糖蛋白(GP) Ⅰb受体将血小板锚定到该部位，使血小板黏附/聚集；
最后与凝血因子Ⅷ(FⅧ)结合，充当FⅧ的血浆载体和稳定剂，保护其免于降解并输送到血管损伤部位，在初级和次级止血中起着至关重要的作用[6-7]。

健康人血浆 vWF 水平约为 10 mg/L，vWF水平受ABO血型、月经周期阶段以及身体压力[8]和炎症的影响。年龄已被证明会影响健康成人和1型vWD成人的vWF抗原(vWF:Ag)和血管性血友病因子瑞斯托菌素辅因子活性 (vWF:RCo) 水平。有研究表明，vWF:Ag每10年增加2 IU/dL,vWF:RCo每10年增加3.0～3.5 IU/dL[9]。另外由于vWF是一种急性期反应物，会随着损伤、手术、妊娠和口服避孕药的使用而增加。因此，vWF测定值的判读必须谨慎进行，通常需要进行多次评估[10]。

仅基于异常实验室参数的 vWD 患病率约为 1%，而临床患病率(仅考虑那些有出血症状的患者)可能更接近0.1%[11]。遗传性vWD主要为常染色体显性遗传，少数为隐性遗传[12]。vWD的主要症状包括皮肤黏膜出血，如鼻出血、易擦伤、小伤口长时间出血、月经大出血以及手术出血，尤其是拔牙时。vWD患者还可能出现胃肠道出血，复发性胃肠道出血是vWD一种独特、难以治疗的症状，常与血管发育不良有关。3型vWD患者可能会出现与血友病患者相似的关节出血[13]。目前已开发了许多标准化出血评估工具 (BAT)，以实现对出血症状的客观评估，可用于筛查可能患有 vWD的患者[14]。

正确的vWD分类的直接临床意义是因为特定类型的vWD患者表现出不同的遗传模式，并且可能需要不同的治疗方法。该病分为3种主要类型[14]：1型vWD的特征是血浆VWF数量部分缺乏，占大多数(约75%)。1 型包括 1C型，一种由 vWF 清除率增加定义的亚型。2型vWD包括所有具有损害vWF功能一个或多个方面质量缺陷的患者 (约25%)。根据潜在的vWF质量缺陷的性质，将2型vWD进一步分为4个亚型 ，分别为2A、2B、2M和2N型 (表3)。最后，罕见的3型VWD (每百万个体中有1个) 的特征是vWF数量完全缺乏。获得性vWD则与某些基础疾病相关，主要包括多发淋巴细胞增生性疾病、骨髓增生性疾病、恶性肿瘤、心血管疾病和自身免疫性疾病等。此外相关药物也可能导致获得性vWD，包括抗凝剂、抗血小板剂、非甾体抗炎药、糖皮质激素、抗菌药物、乙醇、丙戊酸、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂药物、维生素E、羟乙基淀粉和右旋糖酐等。

表3 vWD分型

不同分型vWD的发病机制及其治疗方案不尽相同，因此找到最理想的检测方法来对vWD进行诊断和分型至关重要。目前的检测方法可大致分为3大类，包括筛查试验、确诊试验和分型试验，但归结于vWD的高度异质性和每种试验方法的局限性，迄今为止没有任何一个试验方案可以检测出vWD的所有分型。

3.1vWD的筛查试验 筛查试验，如全血细胞计数、活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间在大多数vWD患者中可能是正常的，因此用处较小。vWD患者出血时间除部分1型外，普遍延长。APTT的延长反映vWD中FⅧ减少,常见2N型和3型，但通常只有FⅧ显著减少才有APTT延长，此时为了排除凝血因子抗体和(或)狼疮抗凝物质等，需要进行纠正试验。

一项回顾性研究表明,血小板功能分析仪膜孔关闭时间筛查vWD的灵敏度为98%,特异度为40%,程序简单易行,分析时间短,能避免标本处理可能发生的vWD误诊,是良好的筛查方法[17]；
但在血小板贮存池病或其他遗传性出血性疾病的诊断方面，该试验的实用意义并不大[18]。除2N型vWD外，严重1型和3型vWD患者的血小板功能分析仪膜孔关闭时间检测结果异常，然而轻、中度的1型和部分2型vWD患者的检测结果也可正常。

3.2vWD的确诊试验 确诊试验主要包含vWF：Ag、FⅧ的活性(FⅧ：C)测定，vWF:RCo以及vWF：RCo/vWF：Ag比值。(1)vWF:Ag：具有vWF量缺陷的患者，其血浆vWF：Ag水平可减低；
vWF：Ag、vWF：RCo或FⅧ水平低于50 IU/dL的患者，如果无法检测到vWF：Ag，则分类为3型；
如果vWF：RCo/vWF：Ag或FⅧ/vWF：Ag比值≤0.6，则分类为2型，如果两个比值均>0.6，则分类为1型[19]。(2)FⅧ：C测定：FⅧ的分泌和血浆半衰期取决于vWF。血浆FⅧ水平常与vWF：Ag水平平行。2N型vWD患者除FⅧ水平较低外，vWF水平正常或较低。FⅧ/vWF:Ag比值可帮助识别2N型，因为该组的FⅧ/vWF:Ag比值小于0.6。由于血友病A患者的比例相似，且FⅧ降低，应进行进一步检测，以区分2N型和血友病A型。(3)vWF:RCo：利用瑞斯托菌素诱导的vWF和GPⅠb之间的相互作用，从而导致血小板凝集。当将足够的瑞斯托菌素(>1 mg/mL)添加到洗涤过的血小板和患者贫乏血浆的血小板悬浮液中时，血小板凝集的程度和速率取决于vWF的水平。由于功能性检测是vWF活性最常见的检测，vWF:RCo检测结合vWF:Ag 传统上被认为是诊断vWD的第一步。

(4)vWF：RCo/vWF：Ag比值：用于区分 1 型和 2 型 vWD，其中 2型的特征是vWF：RCo/vWF：Ag比值小于0.7[20]。通常，当vWF:Ag水平低于30 IU/dL时，当vWF:RCo/vWF:Ag比值大于0.7时，通常诊断为1型vWD[21]。除了区分1型和2型vWD 之外，该比值对诊断至关重要，因为一些2型 vWD 患者的vWF：RCo和vWF：Ag正常，但比值异常。如果vWF：RCo/vWF：Ag比值正常，符合1型vWD的诊断，去氨加压素试验或 vWF 前肽 (pp)/vWF：Ag比值可用于评估 1C 型，因为在快速清除的情况下vWFpp/vWF:Ag比值可能是正常的[22]。

3.3vWD的分型试验 分型试验对vWD的诊断分型具有重要意义，可以在确诊试验的基础上对vWD进行进一步精确分型，主要包括vWF血小板结合试验(vWF：PB)、vWF胶原结合试验(vWF：CB)、低剂量瑞斯托霉素诱导的血小板聚集试验(LD-RIPA)、vWF凝血因子FⅧ结合试验(vWF：FⅧB)、vWF基因测序、vWF多聚体分析等。(1)vWF：PB：用低剂量瑞斯托霉素(0.3～0.6 mg/L)测定vWF结合经甲醛固定的血小板的能力，使用标记抗体测定vWF结合血小板的水平。健康人及1型、2A型、2M型、2N型、3型vWD患者的vWF在此条件下不与或很少与血小板结合，只有2B型vWD患者的vWF：PB增加，而血小板-vWD型vWD患者的vWF：PB正常。(2)vWF：CB：反映vWF结合胶原蛋白的能力，vWF与多种不同类型的胶原蛋白结合并依赖于HMWM。由于与Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的结合特别依赖于HMWM，因此测试这种结合可以作为多聚体分析的替代方法。值得注意的是，1 型 vWD 患者也有胶原结合缺陷的描述，并且与更严重的表型相关。胶原结合或多聚体分析应在怀疑患有 2A、2B、2M 型的患者中进行，在 2A 和 2B 型中vWF:CB和多聚体异常，而vWF:CB 和多聚体正常诊断为 2M 型[23]。(3)vWF：FⅧB：反映患者的vWF与外源性FⅧ的结合能力。该试验是通过酶标板捕获患者的vWF，洗去结合的内源性FⅧ，然后加入已知水平的外源性重组FⅧ(rFⅧ)。2N型vWD患者循环中的vWF 不能与FⅧ正常结合，从而使血浆FⅧ水平降低。(4)vWF多聚体分析：该试验是一种定性分析技术。使用十二烷基硫酸钠蛋白电泳，随后用放射性标记的多克隆抗体/组合单克隆抗体分析凝胶中各种vWF多聚体。另一种是用免疫印迹法，其将蛋白转移到电泳薄膜上，通过免疫荧光法鉴定vWF多聚体。多聚体可见“低分辨率”(区分大、中和小分子多聚体)和“高分辨率”(可将小分子多聚体条带细分成3～8条卫星条带)。低分辨率凝胶系统只有2A型、2B型和血小板-vWD型出现异型多聚体分布；
而1型、2M型和2N型多聚体正常。2A型的特点是缺乏HMWM。

2A/ⅡD亚型的特征在于vWF单体的二聚化受损，这是由于位于vWF的C末端 CK 结构域的几个突变[24]。(5)LD-RIPA：在富含血小板的血浆中加入低剂量(<0.6 mg/L) 瑞斯托霉素，观察血小板聚集反应。2B型vWD患者可能因vWF与血小板结合增加而继发血小板减少，导致过早清除。瑞斯托霉素诱导的血小板聚集已被用于区分2A型和2B型。(6)vWF基因测序：人类 vWF 基因于1985年被克隆。它由52个外显子组成，在 12 号染色体上跨越 178 kb。尽管最近在新一代测序方面取得了进展，但该检测目前尚未普遍应用。2A变异型突变多集中在 vWF2A域段。多数2B、2M、2N型突变多集中在cDNA的特定区域段，而多数1型vWD患者的基因突变不明。尽管基因检测在诊断1型vWD 中的作用仍不清楚，但它在临床上可用于确认2型 vWD(例如2B型和2N型)的诊断，尤其是区分轻度A型血友病和血小板型vWD。此外，分子分析还可用于3型vWD家庭的咨询和产前诊断。2B型突变的位置和生化性质及其影响可能很复杂。vWF A1结构域跨越了vWF蛋白的1 260～1 479个氨基酸，由vWF基因的第28外显子编码。GPⅠba在aa 1244～1481结合vWF；
功能研究表明，不同残基的不同突变，有时同一残基的不同氨基酸替换，可导致与PLT的不同结合亲和力和不同表型。A1环外的突变也可诱导A1环依赖的vWF/PLT结合，并产生2B型vWD表型。此外，各种vWF突变可影响对ADAM-TS13的切割能力，从而产生一系列止血表型[25]。

从预防角度上来说，vWD患者应避免服用阿司匹林以及含有阿司匹林的药物(包括华法林和肝素在内的血液稀释药物、含有ω-3的鱼油胶囊和非甾体类抗感染药物)。对vWD患者的自我护理教育建议是保持充足的水摄入量，选择健康的食物，并保持理想的体质量。如果发生鼻出血，建议患者坐直，保持冷静，应直接按压鼻梁。当vWD患者出现严重的鼻出血或施压后20～30 min仍未停止、血尿或便血、持续数小时或过度出血、骨折、需要缝合或无法止血的伤口、头部受伤、关节或肌肉出血或剧烈疼痛时应寻求医疗护理[26]。对于vWD患者，治疗的总体目标是纠正止血的双重缺陷，即由于低 FⅧ水平导致的异常血小板黏附-聚集和内在凝血。治疗的总体方案是用合成药物去氨加压素 (DDAVP)、氨甲环酸 (TA)等非替代治疗促使内源性 vWF/ FⅧ生成，用含有血浆衍生的 vWF/ FⅧ产品或不含FⅧ的血浆衍生或重组vWF (rvWF)浓缩物进行外源性替代[27]。

4.1非替代治疗 DDAVP 是一种血管加压素的合成类似物,主要通过触发内皮细胞分泌存储的vWF，因此可用于暂时升高血浆vWF水平，是vWD中使用最广泛的治疗方法。DDAVP 可以皮下给药(通常剂量 0.3 μg/kg)、静脉给药(通常剂量 0.3 μg/kg，溶于100 mL生理盐水中输注 20 min)或作为鼻喷雾剂(通常成人剂量 300 μg，儿童剂量 150 μg)。皮下和静脉给药制剂在给药后30～60 min使vWF和FⅧ水平增加2～4倍，并且可以每12～24小时重复一次。2～3 d后出现快速反应(对连续剂量的反应减弱)。鼻内制剂具有不同的吸收，并导致更温和的水平增加。DDAVP的不良反应通常轻微 (心动过速，潮红，头痛)，但经常发生。由于其抗利尿作用，存在低钠血症和液体超负荷的风险。由于这种风险在最小的儿童中最大，因此不建议在2岁以下的儿童中使用。不推荐将DDAVP用于患有活动性心血管疾病、癫痫发作、先兆子痫的女性以及需要持续反应的1C型vWD患者[28]。

vWD类型的最佳有效治疗取决于准确的诊断与分型，并非所有vWD患者对DDAVP都有反应。静脉或皮下注射DDAVP可从血管内皮细胞释放内源性vWF和FⅧ进入循环[29]，是1型轻度vWD患者的首选治疗方法，1C型vWD患者的特点是DDAVP过早清除，因此必须对这些患者进行鉴定，因为他们可能会在2～4 h表现出初始反应，然后降至基线水平。在2N型vWD患者中，该药物通常可纠正FⅧ缺乏，但无法纠正vWF结合内源性FⅧ的能力。因此，由于该部分的血浆半衰期较短，DDAVP无法在适当的时间内维持止血FⅧ:C水平[30]。DDAVP通常是2B型vWD患者的禁忌证，因为缺陷型vWF的增加会导致vWF与血小板结合增加，导致血小板减少症恶化。尽管许多2A型和2M型vWD患者使用DDAVP可能会改善轻微症状，但vWF水平通常没有足够的升高，无法用于手术或大出血。此外,大多数接受 DDAVP 治疗的患者由于快速耐药而从重复剂量中受益较少。

TA 已广泛用于治疗vWD。它可以口服(通常剂量 15～25 mg/kg，每日3次)，或静脉给药(通常剂量 15 mg/kg，每日3次)。它通过与纤溶酶原的赖氨酸结合位点结合来抑制纤维蛋白溶解而起止血作用。可以单用TA，对轻度的黏膜出血有一定的止血作用,也可与DDAVP或 FⅧ-vWF 浓缩剂合用，治疗中度或重度的出血。女性 vWD 患者月经过多时,还可以给予雌激素类药物。雌激素类药物能促进子宫内膜增生，修复出血创面，从而起止血作用。

4.2替代治疗 (1)FⅧ-vWF浓缩剂：目前含有FⅧ和vWF的血浆产品是DDAVP 禁忌或无效患者的首选治疗药物。在接受外科手术或侵入性手术的患者中，使用所有经批准的血浆衍生的vWF/FⅧ产品进行短期预防显示出良好的效果。使用vWF/FⅧ产品时，需要注意的是，一旦输注，FⅧ的半衰期比vWF长。除了外源性注入的FⅧ，注入的vWF 将稳定内源性 FⅧ，这会导致FⅧ水平积累，从而发生静脉血栓栓塞。在具有其他血栓形成危险因素的患者中，单独使用vWF的替代产品可能更可取[23]。(2)rvWF：基因重组的vWF制剂中只含有rvWF,不含FⅧ，在生产过程中保留了HMWM。最近的一项3期试验报告说，rVWF在预防择期外科手术出血方面也有效[31]。重要的是，rvWF产品具有良好的耐受性，尽管其HMWM富集，但没有证据表明血栓形成或发生微血管病并发症。在为vWD患者制订临床治疗计划时，需记住rvWF不含大量FⅧ。因此，对于血浆FⅧ:C水平降低的vWD患者，应考虑在使用首剂rvWF的同时使用rFⅧ，以确保在有大量出血的vWD患者中立即达到止血的FⅧ:C水平。如果不同时输注rFⅧ，在rvWF治疗后大约需要6 h，3型vWD患者的血浆FⅧ:C水平才会升高>40 IU/dL[32]。

在正常的富血小板血浆中，估计有15%～20%的总vWF储存在血小板α-颗粒中，血小板-vWF在血管损伤部位血小板活化后局部高水平分泌。众所周知，一些vWD患者即使在注射vWF浓缩液、血浆vWF水平恢复正常后，仍可能出现持续出血。有报道表明，血小板输注可能有助于减轻这种耐药性出血表型[33]。需要进一步的研究来充分定义血小板-vWF的生物学重要性，特别是它在耐药出血表型vWD中的作用。

近年来，研究人员对 vWD发病机制所涉及的生物学机制的理解以及在vWD 的诊断和治疗选择方面取得了重要进展。然而，vWD 的诊断和分类无疑继续给临床医生带来重大挑战。为了解决一些重要的悬而未决的问题，2021年一个代表ASH、ISTH、NHF和WFH的合作小组已发表最新的关于vWD的循证指南[13]。随着人们对vWD的重视及研究程度不断加深，新一代vWF基因测序方面已取得一定进展。大医治未病，从基因层面诊断及治疗vWD或将是未来一个重要的研究方向。

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