急性髓系白血病mRNA与非编码RNA差异表达谱及CeRNA调控网络分析
时间：2023-04-25 08:00:04 来源：千叶帆 本文已影响人
张月明 ， 罗雅琴 ， 郑伟 ， 徐杰 ， 董雪燕 ， 李善琛 ， 王敬毅
1.山东中医药大学，济南 250000；
2.山东中医药大学附属医院，济南 250000
急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是骨髓造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，其特征为髓系祖细胞快速大量增殖并逐渐取代骨髓正常造血细胞。其临床主要表现为贫血、出血、发热和感染，该病多具有病情急重、难以控制、容易复发、预后凶险等临床特点，对人类的生命健康造成了严重的威胁。已有研究认为，染色体数量或者结构异常、基因突变或表达水平的异常导致细胞过度增殖、分化受阻以及凋亡受抑制是AML发病的主要机制。而这些过程中，细胞信号传导通路以及细胞周期调控异常是白血病发生过程中的关键事件。当前AML的治疗手段包括化疗、造血干细胞移植和生物治疗，这些治疗手段使AML的治愈率能够达到50%［1］，但是AML发展迅速，发病原因及机制较为复杂，其高度异质性导致AML化疗后易复发［2］。因此，深入研究AML的发生发展机制，探究新的分子标志物对于提高药物的治疗效果以及改善AML患者的预后具有重要意义。有研究表明，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）对微小RNA（microRNA，miRNA）具有海绵吸附作用，可以作为内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）与miRNA竞争性结合，从而影响miRNA与mRNA的结合，调控肿瘤的发生、发展和转移［3］。但是，许多lncRNAs在AML发生发展中的生物学作用及临床意义还有待进一步研究。为此，本研究通过生物信息学的方法分析AML相关的差异表达基因，并构建lncRNA-miRNA-mRNA的竞争性内源RNA调控网络，分析差异表达基因的生物学功能及AML发病的潜在机制，旨在为发现AML发病新的潜在机制及治疗靶点提供理论依据。
1.1 材料
GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是一个国际公共数据库，收录了来自世界各国研究机构提交的高通量基因表达数据［4］。在GEO数据库中分别检索AML相关的mRNA、miRNA、lncRNA芯片，获得编号为GSE142698、GSE142699、GSE96535的芯片原始数据。GSE142698芯片数据48例样本中包含AML患者24例，正常对照组24例；
GSE142699芯片数据48例样本中包含AML患者24例，正常对照组24例；
GSE96535芯片数据18例样本中包含AML患者6例，急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia， ALL）患者6例，正常对照组6例。
1.2 方法
1.2.1差异表达基因的筛选 应用GEO数据库中GEO2R功能分析上述数据的差异基因（differential genes，DEGs），利用Excel表格筛选出|log2foldchange（log2FC）|＞1且P＜0.05的差异RNA，然后使用VLOOKUP函数将各个探针名转化为基因名，应用SangerBox绘制火山图对RNA的分布情况进行直观展示，将差异表达倍数绝对值前30的RNA绘制热图进行展示。
1.2.2基因功能注释 在线生物信息学分析工具DAVID［5］（https：//david.ncifcrf.gov/）收集了大量的基因生物功能和信号传导通路研究信息，能够富集分析大规模的基因，并注释其生物学功能和信号通路途径。为进一步研究AML的发病机制，以P＜0.05为标准利用DAVID对初步筛选的差异mRNA进行基因本体（GO）分析，以评估生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular constituent，CC）和分子功能（molecule function，MF）注释的富集程度，京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析用于注释与这些差异mRNA相关的信号通路，利用Sanger软件绘制气泡图进行富集结果的直观展示。
1.2.3蛋白质相互作用网络的构建与分析 将所得29个DEGs导入STRING在线软件中，得出PPI关系，并以TSV格式导出，再将得到的源文件导入Cytoscape软件，以相关参数自由度（degree centrality，DC），介数（betweenness centrality，BC）为条件进行关键基因（Hub基因）的筛选。
1.2.4预测与差异表达miRNAs相关联的mRNAs和lncRNAs 在miRWalk数据库中预测与差异表达miRNAs相关联的mRNAs。利用Spongescan数据库预测与AML相关miRNAs调控的lncRNAs。
1.2.5ceRNA调控网络的构建 为了进一步提高生物信息分析的可靠性，我们将预测得到的mRNAs和lncRNAs与用GEO2R分析得到的差异RNA取交集，并将重叠的RNA作为进一步分析的差异表达mRNAs（DEmRNAs）和差异表达lncRNAs（DElncRNAs）。随后建立了匹配的DElncRNADEmiRNA对和DEmiRNA-DEmRNA对。根据ceRNA理论构建lncRNA-miRNA-mRNA网络，对于给定的共表达lncRNA-mRNA对，筛选其中与某一共同miRNA负性共表达的lncRNA-mRNA对，确定该lncRNA-miRNA-mRNA为共表达竞争的三联体。将上述所有共表达竞争的三联体构建成lncRNA-miRNA-mRNA网络，并使用Cytoscape软件进行可视化。本研究的分析流程如图1所示。
图1 本研究流程图Fig. 1 Flow chart of this study
2.1 AML相关的差异表达mRNAs、miRNAs及lncRNAs
利用GEO2R（∣log2FC∣＞1，P＜0.05）分析差异表达的mRNAs、miRNAs及lncRNAs，在公共数据集GSE142698中共筛选得到29个显著差异的mRNAs，其中18个基因表达上调、11个基因表达下调；
在公共数据集GSE142699中筛选得到70个差异显著的miRNAs，与健康对照组相比，AML样本中有31个miRNA过表达、39个miRNA表达下调；
在公共数据集GSE96535中得到20 005个差异显著的lncRNAs，包括10 248个上调lncRNA和9 757个下调lncRNA。所有mRNAs、miRNAs及lncRNAs分布情况的火山图如图2所示，差异表达倍数绝对值前30的RNA热图如图3所示。
图2 mRNAs、miRNAs及lncRNAs分布情况的火山图Fig. 2 Volcano map of distribution of mRNAs, miRNA and lncRNAs
图3 差异表达倍数绝对值前30的RNA热图Fig. 3 Heat map of Top30 absolute value differential expression multiple
2.2 基因功能注释
DEmRNA被分为3个功能组，在生物过程组中，DEmRNA主要富集于细胞增殖负调控、蛋白磷酸化、细胞分裂、周期蛋白依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节；
在细胞组分组中，DEmRNA主要富集于细胞核、核质和细胞质中；
在分子功能组中，DEmRNA主要富集于蛋白结合功能、ATP结合功能和激酶活性功能。KEGG分析显示其潜在的生物学功能，共获得了23条显著富集的通路。功能注释用SangerBox绘制气泡图进行结果可视化处理如图4所示，DEmRNAs显著富集于细胞衰老、PI3K-Akt信号通路、癌症通路、T细胞受体信号通路等。
图4 DEmRNA基因功能注释气泡图Fig. 4 Bubble diagram of DEmRNA gene function annotation
2.3 PPI网络构建与结果分析
利用String在线工具对差异表达基因构建PPI网络，使用Cytoscape检测PPI中DEGs之间的潜在相关性（图5），其中蓝色为下调基因，红色为上调基因；
以相关参数自由度（DC）、介数（BC）为条件筛选出5个核心基因（图6），分别为MYB、GATA2、CDK4、PKMYT1、CCNB1，均为上调基因。
图5 蛋白互作网络图Fig. 5 PPI net work
图6 PPI互作网络筛选出的核心基因Fig. 6 Hub gene screened from PPI net work
2.4 与差异表达miRNAs相关联的mRNAs和lncRNAs
miRWalk是一个综合型的miRNA靶基因数据。利用miRWalk数据库预测与差异表达miRNAs相关联的mRNAs，得到15 804个预测的mRNAs，与用GEO2R分析的差异mRNAs取交集，最后得到25个mRNAs。利用Spongescan数据库预测与AML相关miRNAs调控的lncRNAs共71个，与通过基因芯片分析得出的差异lncRNAs取交集得到6个lncRNAs。使用Cytoscape（v3.7.1）构建了包含25个mRNA、21个miRNA和6个lncRNA的lncRNA-miRNA-mRNA调控关系网络，如图7所示。
图7 竞争性内源RNA网络图Fig. 7 Competitive endogenous RNA networks
急性髓系白血病是一种由髓系造血祖细胞异常增殖和分化引起的高度异质性的恶性克隆性疾病。治疗AML的方法主要有化疗、靶向治疗和造血干细胞移植等。目前大部分AML患者尤其是青年患者的首选治疗方法仍然是化疗，对于中高危患者来说，不进行移植的治疗复发率高达60%～70%，而且化疗会带来严重的毒副作用［6］。
在当前的生物医学领域研究中，数据分析技术在生物学信号通路的研究、代谢机制和人类疾病的诊断、治疗、预后判断中发挥着重要的作用［7］。ceRNA调控网络理论指出，各种RNA共享共同的miRNA 应答元件（microRNA response element，MRE），这使它们能够竞争性地结合miRNA实现相互调控。ceRNA网络已被证明在基因表达的转录后调控中普遍存在，其在多种疾病特别是肿瘤中的作用已引起广泛关注。为了更好地了解AML的异常基因表达调控机制，本研究分析了多个数据库，获得了AML中异常表达的内源性RNA，建立了ceRNA调控网络。
本研究筛选出MYB、GATA2、CDK4、PKMYT1、CCNB1 5个核心基因，差异基因显著富集于细胞增殖的负调控、蛋白磷酸化、细胞分裂、周期蛋白依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节功能，在细胞组分组中，差异基因主要富集于细胞核、核质和细胞质中。在分子功能组中，差异基因主要富集于蛋白结合、ATP结合和激酶活性。KEGG分析显示，差异基因显著富集于细胞衰老、PI3K-Akt信号通路、癌症通路、T细胞受体信号通路等。本研究构建了包含25个mRNA、21个miRNA和6个lncRNA的CeRNA网络。
MYB是一种广泛存在于真核生物、进化上高度保守的原癌基因。有临床研究表明，MYB可以作为一种转录因子，直接调控多种与肿瘤转移有关的基因，从而影响癌细胞的侵袭、增殖过程，并参与AML的发生、发展、转移过程［8］。GATA2编码一种造血转录因子，且在多种造血细胞的发育中起重要作用，是AML的易感基因［9］。程凯等［10］研究发现，在K562细胞中敲降GATA2后，MYB表达同时下降，证明了GATA2对MYB有调控作用并且在血细胞中起重要作用。CCNB1即G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白B1，主要在G2/M期表达，是有丝分裂中的一种监测蛋白，对于控制G2/M（有丝分裂）过渡的细胞周期至关重要［11］。有研究证实，CCNB1在许多预后较差的癌症如卵巢癌、口腔鳞状细胞癌以及非小细胞肺癌中过表达［12-14］。PKMYT1是Wee家族的一种蛋白激酶，其通过磷酸化Tyr14/Tyr15和磷酸化CDK1-cyclinB复合物而失活CDK1-cyclinB复合物，是细胞周期的负调控因子。先前的研究表明，上调的PKMYT1在肝癌、结肠癌、胶质母细胞瘤等恶性肿瘤的进展中发挥重要作用［15-18］。
通过CeRNA网络的构建，我们推测lncRNA MUC19通过竞争性结合miRNA hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-145a-5p而减少GATA2和CDK6与miRNA的结合从而上调GATA2和CDK6的表达水平；
lncRNA DYNCC2-DT通过竞争性结合miRNA hasmiR-185-5p而减少IL3RA与miRNA的结合从而上调IL3RA的水平。GATA2是重要的正常造血调节因子，主要在早期造血干/祖细胞中表达。髓样分化过程中，GATA2表达下调，而GATA2在白血病中的高表达则反映了造血干/祖细胞分化、发育阻滞，幼稚白血病细胞增多［19］。CDK4、CDK6属于细胞周期蛋白依赖性激酶CDKs家族，如果CDKs表达异常，就会引起细胞周期紊乱，从而导致肿瘤的发生［20］。已有研究发现，CDK6在膀胱癌、结肠癌和卵巢癌［21-23］等多种癌症中高表达。IL3RA（CD123）是白细胞介素3（interleukin-3，IL-3）受体的α亚基，其调节造血细胞的增殖、存活和分化。IL3RA已经被发现在多种类型的白血病中表达，如AML、B-祖细胞急性淋巴细胞白血病（Bacute lymphoblastic leukemia， B-ALL）、T细胞白血病（T cell acute lymphoblastic leukemia， T-ALL）和慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia， CLL）。有实验表明，使用中性抗IL3RA抗体和asIL3RA抗体偶联毒素靶向IL3RA表达细胞，在AML模型中显示出对生存的有益影响［24］。越来越多的证据表明，IL3RA在白血病干细胞中高表达，而在正常造血干细胞中不表达，并且在AML中与治疗反应、微小残留病检测和预后有关［25-27］。因此我们推测lncRNA MUC19、DYNCC2-DT可能以ceRNA的模式调控基因的表达从而影响了AML的进展。
综上所述，通过预测成功地构建了AML中lncRNA相关的ceRNA调控网络，揭示了lncRNA可能通过miRNA间接调控差异表达的mRNA而参与AML的发病过程，为AML的作用机理研究提供了新的思路，同时为其治疗提供了潜在的靶点。
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