间充质干细胞衰老的研究进展
时间：2023-04-25 09:30:06 来源：千叶帆 本文已影响人
陶宁，王华
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有高度自我更新能力、多向分化潜能和低免疫原性的异质细胞群，其来源广泛，可从骨髓、脐带、胎盘、脂肪、牙髓等多种组织中获得[1]。MSCs 可以在不同诱导条件下分化为多种组织和细胞，并分泌多种生物活性物质，其良好的免疫调节与组织修复功能为再生医学提供了新的策略及思路。
在细胞治疗过程中需要大量的 MSCs，这就需要对组织分离得到的 MSCs 进行体外扩增。在临床级的细胞制备过程中发现，体外培养的 MSCs 增殖能力有限，随着传代次数的增加，还可能引发由细胞衰老导致的功能障碍，这极大地限制了 MSCs 的临床应用。并且供体的身体状况、年龄和基因组成等因素也会影响 MSCs 的生物学功能和最终的治疗效果，这其中的差异可能是 MSCs 发生了衰老所致[2]。
衰老的 MSCs 表现为增殖和分化能力降低，蛋白质表达和表观遗传改变。越来越多的证据表明，衰老细胞可以促进多种与年龄相关疾病的发生，从而影响机体健康，缩短寿命[3]。本文主要从 MSCs 衰老的分类、表型改变、诱导机制及相关解决策略等四方面进行综述，以期为干预 MSCs细胞衰老提供参考。
细胞衰老是指当细胞受到外源性和内源性刺激后，处于稳定的细胞周期阻滞的状态，这种状态的维持与大分子的改变和促炎因子的分泌有关[4]。根据触发机制的不同，MSCs细胞衰老大致分为以下四种类型。
1.1 复制性衰老
当细胞经历复制周期后，端粒的长度就会缩短，当缩短到一定限度时，就会发生衰老，这种因为细胞过度增殖所触发的衰老称为复制性衰老，是较为常见的体外细胞衰老类型，它与其他几类细胞衰老密切相关[5]。MSCs 的复制性衰老是一个持续过程，在这个过程中，细胞衰老的相关指标会发生动态变化，细胞的表型、分化潜能和基因表达谱等也会发生相应改变，这些改变都为寻找抗 MSCs 衰老治疗的靶点提供参考依据[6]。
1.2 致癌基因诱导衰老
致癌基因的激活也会诱导 MSCs 衰老，如细胞周期蛋白 E、快速加速纤维肉瘤激酶（rapidly accelerated fibrosarcoma ， RAF ）、 有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和鼠肉瘤病毒癌基因同源物 B1（v-raf murine viral oncogene homolog B1，BRAF）等的激活和（或）过表达都会触发 MSCs 的衰老[5]。致癌基因的激活可能作为一种遗传应激，导致培养的细胞发生不可逆的生长停滞，这个过程通常伴随着细胞核结构的整体变化，特别是衰老相关易染色质灶（senescence-associated heterochromatic foci，SAHF）的形成。在人类衰老的细胞中通常会出现聚集的 DNA/染色质核区域，这些异染色质区域可能会抑制促增殖基因的表达，从而进一步加剧细胞衰老[7]。
1.3 压力诱导衰老
在活性氧簇（reactive oxidative species，ROS）、电离辐射、渗透应激、机械应激、缺氧和热休克等压力的刺激下，细胞也会发生衰老，此类衰老称为压力诱导衰老，它的许多细胞和分子特征都与发生复制衰老的细胞相似[8]。当 MSCs受到 ROS 刺激时，会触发肿瘤蛋白 p53/细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 1A（p21）通路和 p38 MAPK 通路的激活，从而引发不可逆的细胞周期阻滞[9]。因此，调节 ROS 的含量可以直接缓解骨髓来源 MSCs 的细胞衰老。
1.4 发育性衰老
并非所有衰老对细胞产生的影响都是消极的。在非病理状态下，机体也可以通过多种途径或多功能基因的调控而触发细胞衰老，这被称为发育性衰老，是细胞的正常发育过程[10]。其中，胰岛素样信号通路、雷帕霉素靶蛋白和Sirtuins/NAD+三条信号通路在 MSCs 的发育性衰老过程中发挥着重要作用[11]。值得注意的是，这三条通路均与细胞新陈代谢的调控有关，但其发挥作用的具体机制尚在研究之中。
衰老的细胞会发生一系列的特征性改变，如：细胞形态的改变、增殖能力的降低、衰老相关 β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-D-galactosidase，SA-β-Gal）活性的增强和衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）表达的升高等。
2.1 细胞形态改变，增殖能力降低
早期传代的 MSCs 体积小，呈成纤维细胞样纺锤体形态，但在长期培养中会逐渐变得肥大、扁平，并产生更多的伪足和肌动蛋白应力纤维。此外，由于 p53/p21-细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 2A（p16）/肿瘤抑制因子 RB 转录辅阻遏因子 1（RB transcriptional corepressor 1，Rb）这两条信号通路激活，导致 MSCs 细胞周期阻滞，具体表现为细胞有丝分裂活性降低，集落形成单位不断减少[12]。因此，细胞增殖能力的降低，p53、p21、p16 和 Rb 基因的高表达都成为鉴定细胞衰老的有力依据。
2.2 SA-β-Gal 活性增强
虽然衰老细胞经历了不可逆的生长阻滞，但仍保持一定的代谢活性，显示出特征性的基因表达变化，通常表现为SA-β-Gal 活性增强，DDR 蛋白表达的改变，SAHFs 的特征性扩大和持续的 DNA 损伤灶（persistent DNA damage nuclear foci，PDDF）[7,13]。其中，β-Gal 是一种溶酶体酶，在 pH 6.0 时具有催化 β-半乳糖苷的活性。SA-β-Gal 反映了溶酶体的功能障碍，它是广泛使用的细胞衰老标志物，也是目前鉴定细胞衰老最常用的方法之一。在衰老过程中，由于溶酶体活性增加和胞浆 pH 值改变，SA-β-Gal 阳性的MSCs 百分比明显增加[7,14-15]。但是由于衰老表型的复杂性，目前仍没有任何指标能够单独鉴定 MSCs 的衰老。
2.3 SASP 表达升高
SASP 是一种复杂的、快速变化的多组分成分，并在一定程度上随时间变化[16]。SASP 的一个显著特征就是衰老细胞分泌大量的促炎分子，包括细胞因子、趋化因子、生物活性脂质和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）等[17]。越来越多的证据表明：细胞衰老与机体衰老及年龄相关疾病的发生发展密切相关。
临床级 MSCs 的疗效可归功于有益旁分泌因子的作用。因此，包含这些分泌因子的 MSCs 条件培养基在各种疾病的治疗中发挥有益作用。如：在骨髓来源的衰老 MSCs中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胎盘生长因子（placental growth factor，PGF）和肝生长因子（hepatic growth factor，HGF）等促进血管生成的因子分泌减少，而血栓反应蛋白-1（thrombospondin-1，TBS1）和纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）等抗血管生成因子分泌增加[18]。因此，衰老会对血管生成产生负面影响，并直接影响 MSCs 的治疗效果。
正常的体细胞增殖能力有限，具有有丝分裂能力的细胞通过细胞衰老来响应多种应激原的刺激。这些应激原主要包括：端粒功能失调、DNA 损伤、线粒体功能障碍、细胞自噬失衡以及表观遗传改变等，其中 DNA 损伤反应（DNA damage response，DDR）居于核心地位。
3.1 DNA 损伤
DDR 对于细胞基因组稳定性和组织存活都是至关重要的。DNA 损伤可通过改变特定基因的表达，直接导致细胞功能障碍；
也可以通过触发细胞对损伤的应答，间接导致细胞功能障碍，从而能够更广泛地改变基因表达[19-20]。由于DNA 复制错误以及暴露于内源性和外源性诱变剂环境中，DNA 损伤会在生物体的整个生命周期内累积。
细胞在不断复制过程中，端粒会发生缩短，这是 MSCs衰老过程中发生的内源性变化之一。当端粒缩短到一定程度时，就会导致 DNA 无法继续复制，染色体的稳定性也无法保证，从而触发由 p53 介导的 DDR，进而诱发衰老应答。
此外，氧化应激、电离辐射、缺氧和机械应激等其他因素也可能导致细胞 DNA 损伤，并引起 DNA 双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs）[6,21]。DSBs 是细胞衰老有效的激活因子。
当细胞发生 DNA 损伤时，会触发 DDR 网络，从而感知损伤并启动突变修复[22]。DDR 网络首先通过激活细胞周期相关蛋白 p53 的表达，诱导细胞周期蛋白依赖性激酶 2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2）的调节基因p21WAF1/Cip1的表达，从而使细胞进入周期阻滞状态[22]。当细胞持续产生 DNA 损伤应答信号时，p38MAPK 介导的线粒体功能障碍和 ROS 的产生会激活 p16INK4A，导致 CDK的抑制和 Rb1 的激活，从而诱导衰老[23]。因此，增强 DNA修复途径的活性可能有助于缓解 MSCs 的衰老。
3.2 线粒体功能障碍
线粒体作为细胞能量代谢的中心，参与多种细胞活动，如细胞基质的代谢、凋亡和信号转导通路的启动。发生复制性衰老的 MSCs，其线粒体会变长，当受损严重时，会出现破碎的、片状线粒体，并引发线粒体功能障碍[5]。线粒体功能障碍则可通过破坏胞质中 NAD+/NADH 的比值、ROS的产生和其他机制诱导衰老。
其中，ROS 在线粒体中的过度积累是造成线粒体功能障碍的主要原因，而辐射、紫外线、缺氧和低温等外部因素都会促进 ROS 的产生。ROS 作为一种代谢副产物，可以通过产生次级活性代谢产物来诱导氧化和其他类型的细胞反应。虽然生理水平的 ROS 对于细胞的增殖和分化都是必要的，但过量的 ROS 可以诱导 DNA 损伤并加速端粒缩短，这两种损伤均可激活 DDR，从而触发 MSCs 的衰老[24]。与正常细胞相比，线粒体功能障碍所致的衰老（mitochondrial dysfunction-associated senescence，MiDAS）MSCs 会释放大量 ROS，导致 DDR 的持续激活，从而在衰老进程中形成正反馈[25]。研究表明：色氨酸代谢产物如5-甲氧基色氨酸（5-methoxytryptophan，5-MTP）和褪黑素，可以通过维持线粒体完整性和功能，减少 ROS 生成，以缓解金属汞诱导的 MSCs 衰老[26]。
3.3 细胞自噬失衡
自噬是一种高度保守的生理过程，在真核细胞中广泛存在。它可以调控分子降解和细胞器更新，因而在生理和病理条件下对于维持细胞稳态都发挥着关键作用，但是过度的自噬可能引起细胞死亡[27]。减少细胞内损伤的积累有助于维持细胞静止期和衰老状态之间的平衡，细胞自噬可以通过降解蛋白质和线粒体等受损的细胞成分，从而减少与细胞衰老相关的损伤[28]。衰老的 MSCs 通常表现为自噬减少，这会导致细胞中蛋白酶水平失衡，线粒体活性、氧化应激和代谢状态的提高，从而进一步加剧了细胞的衰老[22]。自噬作为抗衰老的靶点已被广泛应用，通过用 AMPK 激活剂阿卡地辛和 Sirtuin 激活剂烟酰胺抑制雷帕霉素靶蛋白 C1（mammalian target of rapamycin C1，mTORC1）可以促进自噬，保留 MSCs 的自我更新和分化能力，并减轻与细胞衰老相关的变化[29]。
3.4 表观遗传的改变
表观遗传的变化既是对细胞衰老的响应，也是影响衰老发生的重要因素[30]。表观遗传的变化是指在 DNA 序列不改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，DNA 甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等在此过程中发挥了重要作用[31]。研究表明，来自老年个体的 MSCs 表现出异染色质相关 H3K9me3 表达普遍减少以及异染色质维持蛋白表达下调[32]。在 Werner 早衰综合征的胚胎干细胞模型中也出现类似的改变，研究发现随着年龄的增长，异染色质紊乱可能会导致细胞功能障碍[32]。目前的研究结果显示：表观遗传的变化是衰老 MSCs 的普遍特征，但是还需要进一步研究来明确这些变化与 MSCs 衰老的因果关系。
目前，对于细胞衰老的调控研究主要集中在利用基因工程、基因编辑和药理学等方法调节衰老关键信号分子/通路及相关细胞因子等的表达。
细胞基因工程是一种可预防细胞衰老的方法。核小体组装蛋白 1（nucleosome assembly protein 1，NAP1）是一个高度保守的基因家族，它与真核生物中的核小体装配、组蛋白修饰、转录调控和细胞增殖等过程密切相关。研究发现，其家族成员 NAP1L2 表达水平的升高与骨髓来源 MSCs的衰老和成骨潜能受损相关。实验通过感染病毒敲低NAP1L2 基因的表达，结果显示 MSCs 的 SA-β-Gal 阳性细胞数减少，衰老及炎症相关基因表达水平降低[33]。
基因编辑技术的应用是近年来的研究热点，如诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）衍生的MSCs，细胞在重编程过程中会发生再生。其 DNA 甲基化谱保持供体特异性，而组织特异性及与年龄和衰老相关的DNA 甲基化谱则在重编程过程中被清除，从而表现出更好的细胞活力，使得细胞可以传代超过 40 次而不表现出衰老特征[34-35]。
药理学方法也可以作为抑制体外培养中 MSCs 衰老的有效手段。抗坏血酸在许多生物过程中都扮演辅助因子的角色，它作为一种天然的抗氧化剂，能够有效清除细胞中的ROS[36]。研究结果发现，抗坏血酸可以通过激活 Akt/mTOR信号通路抑制 MSCs 中的 ROS 生成，并减少 D-半乳糖处理的 MSCs 中 SA-β-Gal 阳性细胞的数量和 p16 的表达，缓解 MSCs 的衰老[37]。
由于衰老诱发因素的多样性和复杂性，以及衰老调控机制之间存在错综复杂的联系，致使 MSCs 衰老现象不能用单一的机制进行阐释，也无法通过单一的方法来干预多种类型的细胞衰老。虽然目前已有的手段对于体外干预细胞衰老显示出初步成效，但是普遍存在操作技术复杂、持久安全性无法保证的缺点。
细胞衰老是一种由不同应激刺激的异质性细胞状态。在体内，衰老细胞的慢性累积会导致组织功能障碍和各种年龄相关疾病发生风险的增加；
在体外，衰老细胞会对其细胞治疗的效果产生严重影响，这就需要我们对 MSCs 的衰老进行多方面多层次的深入探索。
首先，深入探索 MSCs 衰老的形成机制。MSCs 衰老的诱发因素及细胞表型的改变错综复杂，MSCs 衰老分子机制的阐明有助于进一步明确 MSCs 功能障碍的驱动因素和效应因素，从而在缓解 MSCs 功能障碍以及提升临床级MSCs 疗效方面提出可行性方案。
其次，发现细胞早期衰老的标志物。目前建立的衰老标志物如 p16、p53 和 SA-β-Gal 等均可用于识别衰老细胞，但都不能作为鉴定早期细胞衰老的独立指标。因此，我们还需要探究与 MSCs 衰老相关的特异性的新靶点，以更好地鉴定 MSCs 的早期衰老。
最后，提出干预 MSCs 衰老的新策略。目前已有的抗MSCs 衰老手段很多，但是在持久的安全性方面都无法得到保障，这极大限制了这些干预手段在临床上的应用。因此，对干预 MSCs 衰老新策略的探究，仍是未来研究的发展方向。
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