肿瘤干细胞培养与分选鉴定的研究进展
时间：2023-04-25 10:45:05 来源：千叶帆 本文已影响人
郭德志，张建鹏
（1.海军军医大学基础医学院学员三大队八队，上海 200433；
2.海军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)
近10 年来恶性肿瘤的发病率保持每年约3.9%的增幅，死亡率保持每年2.5%的增幅，引起了人们的高度重视[1]。对于多数恶性肿瘤而言，外科治疗、放射治疗、化学治疗、靶向治疗以及免疫治疗等方法可以杀死患者体内的大部分肿瘤细胞，却难以从根本上治愈癌症。这一现象可以用肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)理论加以解释。CSCs 具有自我更新、无限增殖和抗化学毒物损伤的能力，与肿瘤细胞的生长、转移和复发有着极为密切的关系。CSCs有5个独立的鉴定标准，包括自我更新能力，占总肿瘤种群的小部分，可复制的肿瘤表型，向非致瘤细胞的多潜能分化能力，以及独特的细胞表面抗原表型[2]。近年来，CSCs 在各种肿瘤中不断被发现，例如前列腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等。对CSCs 的研究和靶向疗法的尝试，均印证了该学说[3-7]。如果能从肿瘤细胞中分离、培养CSCs，建立可靠的肿瘤模型，则有助于揭示CSCs 的功能特性和肿瘤发生机制，进而靶向消除干细胞样肿瘤细胞群，将有望成为治疗恶性肿瘤的有效策略之一。因此，本文主要对CSCs的常用培养和分选鉴定方法及其原理进行综述，并对各类方法进行总结和对比。
1.1 非黏附培养系统
非黏附培养系统是将细胞系培养在具有非黏附表面的培养塑料制品中。一般采用在培养皿上涂覆琼脂糖薄膜的方式使细胞悬浮，或者采用胰酶解离贴壁细胞后再种植在DMEM培养基上的方法[8]。通常非黏附条件下生长的细胞球失去锚固，黏附分子通过信号传递途径影响细胞凋亡相关基因，较易导致凋亡反应。而对于CSCs 细胞，当细胞球体处于恶劣环境时可以通过上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程，激发其表达相关特性的潜力，从而得到富集培养的细胞球。相比于需要2~6 周的传统培养方式，非黏附培养系统5~7 d 内可生成球体，具有良好的时效性；
并且这种改良的非黏附性培养系统不需要添加生长因子，成本效益高[9]；
同时，相比于贴壁的细胞，肿瘤细胞球的集落形成能力、自我更新能力、细胞侵袭力、化疗耐药性和可能的干细胞标志物的表达均显著增加[8，10]。
1.2 三维(3D)培养系统
非干细胞样癌细胞似乎可自发地重新转变为干细胞样癌细胞[11]。研究表明，来自人结肠癌患者的小部分无干细胞标志物的细胞亚群可表现出非随机的自我更新能力和致瘤性[12]。因此，基于CSCs标志物的培养方法并不可靠[13]。
目前，培养扁平单层细胞的二维(2D)平台仍然是细胞测定研究最常用的培养方法。2D细胞培养系统简单、方便、经济高效且应用广泛。但是，传统2D 培养的局限性无法模拟体内结构，与真实微环境差别较大的2D 环境可能在癌细胞对抗癌药物的预测实验中造成误导性结果[14]。原因在于实体肿瘤以3D构象生长，即实体肿瘤周围环绕着各种非肿瘤细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。在这些条件下，肿瘤细胞往往暴露于次优生长条件下，如缺氧或低营养水平，并受到细胞间接触抑制或来自周围肿瘤和非肿瘤细胞的各种信号的影响[15]。因此，3D培养系统在研究癌细胞的生长、增殖、分化、转移及肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)等方面显现出明显优势[16]。于是出现了用软三维(3D)纤维蛋白凝胶选择和培养CSCs的机械方法。研究显示，机械力可以调节胚胎干细胞的分化和自我更新，肿瘤细胞的分化能力也与培养基质的刚性有关[17-18]。因此，使用软基质的机械策略可从癌细胞选择CSCs。3D 培养系统比单层培养物更有效地模拟组织样结构，在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及卵巢癌中均已被应用[19-20]。3D培养系统包括多细胞球体形成(液体覆盖培养和悬挂液滴法)、水凝胶培养、生物反应器培养、生物打印和支架培养。虽然每种3D培养的技术和方案不同，但其目的均尽可能模拟细胞在真实情况下的微环境。
相比于传统的2D 纤维蛋白底物，3D 软纤维蛋白凝胶具有“激发效应”，使培养出的细胞表现出更高的致瘤性，例如在阿霉素或顺铂培养条件下不易凋亡；
能培育出体积相对较大的球状体并更快地生长；
将肿瘤细胞球接种到小鼠体内，表现出更高的致瘤能力，细胞球能在恶劣环境中存活并且大多数最终长成大肿瘤。而且相比于根据标志物分选出的CD133+、CD44+细胞，该方法培养出的细胞更易形成肿瘤。总之，3D软纤维蛋白凝胶凭借其相对于癌细胞刚度的柔软性，可以控制癌细胞亚群的分化行为和增殖速度，因此这种方法多用于培养、选择目标细胞系中，且此方法不依赖于干细胞标志物[13]。
1.2.1 支架培养3D 支架通常是由多种材料构成的天然或合成3D 结构，不同支架具有不同的孔隙率、渗透率、表面化学和机械特性，会对细胞培养造成不同的影响。它们主要用于模仿某种特定细胞类型在特定组织的体内微环境。因此，天然或合成的水凝胶是支架的理想材料[21]。但水凝胶一般价格昂贵，另一种选择则是与其他支架产品一起使用，比如合成的纳米纤维材料[22]。有研究表明，间距为50 μm、孔隙率为1∶2的单层支架效果最佳[23]。需要注意的是，支架培养的三维模型构建需要较高成本，且不同批次的三维支架重复性低[19]。
1.2.2 悬滴技术悬挂液滴(简称悬滴)技术相对简单且适用于许多细胞系，几乎每个液滴均可以生成一个3D 球体。悬滴技术最初在培养皿盖中进行，方法是将少量具有特定细胞密度的细胞悬浮液(15~30 μL)滴落到盖子上，随后倒置，由于表面张力而将等分试样的细胞悬浮液变成悬挂滴剂而不会滴落。因此，细胞被迫积聚在液滴的底部，液-空气界面处，并进一步聚集和增殖，直到形成球体[14]。后来，有了代替培养皿板的悬挂式滴板。由于滴板与液体处理器系统、高通量加样设备均能兼容，使其操作起来更加简单，且每块板可以生产更多的3D球体，但价格昂贵[21]。
1.2.3 生物反应器生物反应器3D 培养系统的一般原理是，通过轻轻搅拌，旋转腔室或使用泵系统通过支架灌注培养基，将具有最佳细胞密度的细胞悬浮液通过连续搅拌填充到腔室中。生物反应器配有介质流动系统，以提供营养循环，排出代谢废物，且生物反应器内物理和化学因素具有均匀性[14]。因此，基于生物反应器的细胞培养模型适用于密集的细胞扩增和大规模生物分子生产，例如抗体或生长因子。该方法的优点在于能够精确和可重复地控制细胞培养所需的许多环境条件，能够在生长过程中维持和监测环境[19，24]。
培养CSCs 的要点是需基于其生长特性进行培养的；
关键点在于如何模拟TME；
难点在于如何建立稳定的体外培养条件，如何防止CSCs 的分化；
而如何让培养方法操作简单、成功率高、便于推广，需要更进一步探究。值得注意的是，上文只是阐述了CSCs 的培养方法，不同来源的肿瘤特性不同，培养条件也不完全相同，在实际操作中需要经过摸索才能针对不同的CSCs建立稳定的体外培养条件。
鉴定方法通常为免疫组化染色、RNA提取和逆转录聚合酶链 反 应 (reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)以及体内致瘤性研究。除此之外，还有Western blot、化学敏感性和放射敏感性测定、血细胞比容分析、cDNA 微阵列分析等方式。在目前的研究中，CSCs的分离鉴定并不是采用单一的方法，而是选用多种方法联合以获得纯度更高的CSCs。
2.1 侧群细胞分选法
侧群细胞(side population，SP)又称边缘细胞，其特点是可以将进入细胞核的荧光染料Hoechst33342排出胞外，在荧光显微镜下观察或流式细胞仪检测时表现为不着色。这类细胞是1996 年Goodell 等在用Hoechst33342 染色法研究骨髓时发现的，他们将其命名为SP 细胞。而随着对SP 细胞研究的深入，发现SP细胞可发生不对称分裂、具有自我更新等功能[25]，这些特性与CSCs一致，所以通过分选SP细胞，可达到富集CSCs的效果。目前已证实在多种肿瘤细胞系中存在SP细胞，例如在上皮性卵巢癌细胞系中SP 细胞占比0.5%，人结肠直肠癌组织中SP 细胞的比例为0.90%，胃癌BGC-823 细胞株中的SP 细胞约占2%，大肠癌细胞系Lovo中约含0.54%~0.62%[26-29]。
一种方法是应用无血清培养液(serum-free media，SFM)分离SP 细胞：①将需要培养SP 细胞的细胞系在传统血清培养基(serum-supplemented media，SSM)中传代；
②选择对数生长期的细胞，清洗后经胰酶消化并计数，重悬于SFM中，接种于孔板继续培养；
③待增殖形成细胞球3~4 d 后，再进行重悬传代。如此反复，在SSM和SFM培养基中交替培养，其中能形成致密形态一致的肿瘤球且传代后肿瘤球的总数大量扩增的这部分肿瘤球细胞，即为SP细胞[29]。
根据SP细胞能够将荧光染料Hoechst33342泵出细胞外而使细胞呈弱荧光信号这一特性，还可以使用流式细胞分选技术分选SP细胞[30]。进行2~3次分选，分析SP细胞比例变化，直至能够获得稳定比例的SP细胞[26]。此方法优点是操作简便，但是分离效率低，且染料有一定的细胞毒性，影响细胞活性。
SP 细胞分选法主要用于富集耐药性强的CSCs，因此，在研究新型药物对CSCs 的杀伤效果时，常用此方法富集细胞。例如，研究肉桂醛对胰腺癌细胞的作用，研究灵芝烯酸B对胃癌细胞的作用以及槐耳对肝癌细胞的作用等均采用的SP细胞分选法[30-32]。但需要注意的是，SP 细胞并不一定等同于CSCs 本身[33-34]。对于不同类型的肿瘤，SP 细胞分选培养法能否适用，仍需要进一步研究。
2.2 药物选择分离
根据CSCs 假说，CSCs 的基本特性是对化疗具有抗性。由于这种特征，CSCs 可以在治疗过程中存活并再生肿瘤。因此，使用特定药物例如紫杉醇和顺铂培养细胞，辅以表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、胰岛素或标准含血清系统，在药物选择和无血清培养系统下形成的非贴壁细胞球，对顺铂、紫杉醇、阿霉素和甲氨蝶呤的耐药性更强[35]。
具体方法为：先在无顺铂的培养液中培养对数生长期的细胞，传代后依次递增顺铂浓度诱导细胞耐药，最后得到稳定生长且可传代的耐药细胞即为干细胞[36]。可先通过细胞增殖实验CCK-8 或MTS 法计算药物抑制率IC50，进行初步检验，再通过实时荧光定量PCR、流式细胞术和Western blot 等方法，检测肿瘤干性相关基因的表达水平，对筛选获得细胞的干性进行验证[36]。结果表明，在低浓度或高浓度下应用连续或多步骤药物选择建立的多药耐药癌细胞系，即使在体外长期培养，或在不同条件下培养数年甚至数十年，其肿瘤细胞培养物中仍然拥有少量致瘤细胞，这进一步证明了其具有干性[37]。
2.3 RNA提取和实时荧光定量PCR
通常利用商品化的试剂盒提取RNA，实时荧光定量PCR是通过标准曲线来对样本进行定量分析，用于分析mRNA的PCR引物可以是GAPDH，或者其他保守序列。MYC、OCT4、SOX2、Nanog 几乎在各类CSCs 中均呈现过表达，可作为分析基因[38]。用该方法分析的基因最好是：①包括CSCs分子标记和调节CSCs 增殖，自我更新和多能性的基因，以帮助确保CSCs分离株在培养物中的稳定性；
②包括参与CSCs 不对称细胞分裂、迁移和转移的基因，以及相关的信号转导途径，以帮助促进CSCs表征以及目前正在测试的治疗剂的靶标。
2.4 流式细胞术
与正常癌细胞不同，CSCs 具有独特的细胞特征。其中，CD133、CD44 和上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)等是常用且适用于大多数CSCs 鉴定的非特异性标志物[34]。乳腺癌干细胞的特异性标志物主要为CD29 和CD90 等；
肝癌干细胞的特异性标志物是CD90 和CD13；
头颈部鳞状细胞癌的干细胞标志物为CD271；
子宫内膜癌的干细胞标志物CD117；
胰腺癌CSCs的特殊标记物为CD24[39-43]。根据特定的标记，流式细胞术可对细胞表面标志物阳性和阴性的肿瘤细胞进行分选。因为CSCs 在肿瘤细胞中相当稀少，所以该分选方式需要获得大量备选的肿瘤细胞。在分选阳性比例很低的CSCs时，还经常联合使用阳性分选和阴性分选，以得到高纯度的CSCs。此外，氧含量影响干细胞标志物的表达，胰蛋白酶处理细胞培养物也可能影响CD133+细胞的表达，因此，需要考虑实验程序是否可能会影响后续研究及CSCs的产量[44]。
2.4.1 荧光激活细胞分选荧光激活细胞分选(fluorescenceactivated cell sorting，FACS)是一种成熟的方法。首先将荧光标记的抗体与CSCs 表面的标记结合，再将细胞以流注的形式通过细胞分选器。在出口，荧光被激光所激发，发射的荧光信号通过光电倍增管放大，带有不同荧光标记的细胞被分离，即可分选出CSCs[34]。
FACS 的优势在于多个标记可以同时排序，并且具有高特异性。同时，FACS 可检测的特征不仅局限于表观特征，而且可检测细胞信号通路的活性和蛋白质的相互作用，这很好的解决了实体瘤干细胞缺乏膜抗原的问题。但FACS 设备价格昂贵且对无菌条件的要求很高，因此，建议在培养基中加入青霉素和链霉素。另外，喷嘴尺寸会影响分选的速度，应选取CSCs直径4~5倍即85~100 μm的喷嘴；
为避免分选时间过长导致细胞活力降低，细胞应以每毫升1×107~2×107个的浓度重悬[44]。
2.4.2 磁激活细胞分选磁激活细胞分选(magnetic-activated cell sorting，MACS)是一种简单高效的方法。在能与表面标记结合的抗体上附加磁珠，当肿瘤细胞通过置于磁场中的分离柱时，与磁珠结合的细胞通过磁力被保留在分离柱的内表面，未结合的细胞则通过分离柱。随后，可以从柱中洗脱表面标记阳性细胞。
由于磁珠由氧化铁和多糖涂层制成，且体积微小随时间会被去除，其对细胞活力的影响很小，因此该方法适合大量细胞分选。尽管如此，该方法的应用依旧受到限制：一是分选前的处理比较耗时；
二是分选设备和磁珠价格昂贵，磁珠不能重复使用；
三是该方法每次分选只能依赖于单个膜抗原，而实体瘤干细胞却常常缺乏膜抗原的表达[44]。
2.5 Western blot检测
该方法作为传统的分选鉴定方法，简单方便且普适性高，基本适用于所有类型的CSCs。同时，其高度的灵敏性降低了实验成本。但是，如果操作不当，容易造成产生多个谱带、褪色等问题，得到假阳性或假阴性反应。该方法可作为验证实验分析鉴定分选结果。
由于CSCs 的定义还不够明确，只能根据其特性对CSCs 加以判断，目前仍无标准的培养方法，因此需要多种方法配合使用才能得到相对理想的干细胞。同时，选择分离方法时，需要从研究目的、实验成本和实验流程等角度来考量。此外，通过上述总结，不难发现CSCs 的培养和鉴定方法在过去的研究中有了显著进步，但仍旧存在许多问题：悬浮培养法导致细胞粘贴在一起，难以获得单克隆细胞；
培养周期长，导致细胞失去干性；
标记SP群的染料有毒，影响细胞活力。从经济的角度考虑，那些高效的方法成本往往较高。从临床的角度考虑，为了在手术中可视化CSCs，也需要寻找更特异、无毒的CSCs 染料。同时，需要制定用于分离和富集CSCs 的标准化方案。最后，在此基础上，需要对干细胞标志物和相关通路进行进一步的探索。比如，在研究中发现有些培养方式下的干细胞会表达Sox2，这可能对CSCs在体内的自我更新和生长至关重要。还有一些标志物是异常信号通路的一部分，会导致肿瘤细胞对化疗产生耐药性。这些研究可以促使靶向药物的研发，从而解决临床肿瘤的耐药复发等问题。
