电化学生物传感器检测汞离子的研究进展
时间：2023-04-25 20:35:05 来源：千叶帆 本文已影响人
李云蕊,刘俊杰,艾明雄,孙显国
(1.云南省楚雄彝族自治州农产品质量检测中心，云南 楚雄 675000;2.昆明正大猪业有限公司，云南 昆明 650000)
工业生产排放的汞离子(Hg2+)直接破坏自然环境，且通过食物链进行生物累积进一步威胁公众健康。Hg2+对蛋白质和酶中的硫醇基具有高亲和性，即使极低剂量的接触也可能导致认知和运动障碍，增大心血管疾病，甚至癌症的发生几率[1-3]。因此，在低浓度下对Hg2+进行灵敏检测对于环境保护和疾病预防都具有重要意义。Hg2+常见的检测技术包括原子吸收光谱法[4]、原子荧光光谱法[5]、电感耦合等离子体质谱法[6]、X射线吸收光谱法[7]。然而这些技术不仅需要大型专业仪器和训练有素的工作人员，而且存在繁琐、耗时、不适合便携式使用、无法现场检测等局限。因此，开发一种简单、快速、灵敏、选择性监测Hg2+的高效分析方法的非常必要。
与传统分析技术相比，电化学生物传感器在便携性、低成本、简单性、选择性、灵敏度方面更具优势[8]。近年来，研究人员在构建新型Hg2+电化学生物传感器方面做出了许多贡献。特别是，随着DNA纳米技术的发展，将新型DNA纳米机器和多种核酸信号放大策略集成到电化学生物传感器的开发研究中，对Hg2+检测的特异性优化、灵敏度提升具有重要意义[9-11]。本文阐述了近年来构建的Hg2+电化学生物传感器的研究进展，主要包括简单的Hg2+电化学生物传感器、核酸信号放大策略对Hg2+检测灵敏度的提升，以及纳米机器在Hg2+电化学生物传感器中的应用。
1.1 电化学生物传感器原理
电化学生物传感器主要包括生物识别元件、信号转换器、数据分析处理系统三部分(图1)。当生物识别元件与目标分析物特异性结合时，其相互作用经信号转换器转化为电流、累积电荷、阻抗或电位的变化，数据分析处理后即可输出与分析物浓度相关的电信号，实现对分析物的定量检测[12]。针对不同的检测需求，全细胞、组织、酶、抗体、适配体、DNA等均可作为生物识别元件，使得电化学生物传感器在疾病诊断、环境监测、食品质量管理等领域得到广泛应用[13-15]。
图1 电化学生物传感器示意图
1.2 T-Hg2+-T结构
寡核苷酸是一种高效、环保,具有生物特异性的分析工具。一些重金属离子对某些DNA碱基具有选择性，可通过配位键形成稳定的碱基对。2004年，Ono和Togashi[16]首次报道了当Hg2+存在时，包含胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(T-T)错配碱基对的DNA双链呈现较强的热稳定性,而其他重金属离子，如Cu2+、Ni2+、Pd2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Pb2+等，对T-T错配DNA双链的热稳定性并无显著增强。经核磁共振实验，进一步证实了Hg2+易与T-T碱基对特异性结合形成T-Hg2+-T结构，其结合的相互作用力甚至高于DNA双螺旋结构中的T-A沃森-克里克碱基对[17-18]。因此，依赖于Hg2+与T-T错配碱基的特异性结合可以设计高选择性的Hg2+电化学生物传感器。
1.3 基于T-Hg2+-T结构构建的简单电化学生物传感器
如图2所示，Wu等[19]人通过自组装将富T碱基的DNA单链固载在金电极上，利用Hg2+和T碱基之间的特异性结合作用来选择性地将Hg2+捕获于电极表面，并采用差分脉冲伏安法对Hg2+进行测定，开发了一种基于T-Hg2+-T结构的简单传感器一步实现Hg2+检测。另外，Niu等[20]人采用两种T-T碱基错配的DNA单链P1和P2：P1首先固定于电极表面，P2标记有电活性物质二茂铁(Fc)。Hg2+诱导作用下，P1和P2之间凭借T-Hg2+-T结构，成功在电极表面组装形成稳定DNA双链，并产生与Hg2+浓度成正比例的Fc电化学信号，实现在 1 nmoL/L～10 μmoL/L 浓度范围内对Hg2+线性响应[20]。因此，可以说，T-Hg2+-T结构的应用显著促进了Hg2+电化学生物传感器的发展[21-22]。
图2 一步法检测Hg2+的电化学生物传感器示意图
基于T-Hg2+-T结构构建的简单电化学生物传感器中，多个Hg2+对应一个DNA探针产生较弱的电信号响应，因此灵敏度相对有限。随着各种信号放大策略不断被提出[23]，研究人员越来越关注核酸信号放大策略在Hg2+电化学生物传感器中的应用，以追求更优越的性能。
2.1 酶辅助的Hg2+循环放大策略
外切酶Ⅲ(Exo-Ⅲ)不依赖于特定核酸序列，不需要特定的识别位点，具有3’至5’端外切脱氧核糖核酸活性，可以催化具有3’平末端或凹陷末端的双链DNA从3’端逐步降解。利用这一特性，ExoⅢ已被用于辅助Hg2+的循环利用，以放大信号，提高Hg2+检测的灵敏度[24-27]。在Wu[28]构建的传感器中(如图3)，一端标记有电活性物质Fc的DNA单链P1被固定在金电极表面，Hg2+存在时P1与DNA P2互补形成3’平末端双链，触发Exo-Ⅲ从3’端逐步降解该双链DNA中的P1，导致电极表面Fc的数量减少，同时释放出Hg2+。ExoⅢ辅助释放出的Hg2+继续参与以上这一过程，使得Hg2+被充分循环利用，实现少量的Hg2+即可减少大量的Fc，产生显著的Fc信号降低，检测限低至 6.2 pmoL/L。
图3 基于Exo-Ⅲ辅助Hg2+循环放大策略的传感器示意图
2.2 杂交链式反应
杂交链式反应(HCR)[29-31]作为一种强有力的信号放大技术，由于非酶性和等温性而显示出一定的优势。HCR由Dirks和Piece率先报道[32]，一个典型的HCR(如图4)包括一对末端有粘性的互补DNA发夹(H1、H2)和一个启动子(I链)。在没有I链的情况下，H1和H2稳定共存。一旦引入I链，由于I链与H1的粘性末端及茎部碱基互补，H1的发夹结构就会被打开。而打开的H1与H2的粘性末端及茎部碱基也互补，使得H2的发夹结构继续被打开，从而触发级联反应导致H1、H2、H1、H2、H1......依次被循环打开，形成具有H1-H2多重重复结构的长DNA双链聚合物。基于这样的HCR放大原理，Yu等[33]人结合特异性T-Hg2+-T结构，制备了一种新型的电化学生物传感器。在目标物Hg2+存在的情况下，T-Hg2+-T作用使得HCR的启动链成功被引入电极表面，触发H1和H2级联反应自组装成长DNA双链聚合物。此过程巧妙地将少量的Hg2+转化成极长的DNA双链聚合物，DNA双链聚合物中进一步嵌入大量的电活性物质甲苯胺蓝TB以输出放大的信号，实现高效检测Hg2+，检测限低至 0.2 pmoL/L。
图4 HCR的工作原理
2.3 DNAzyme辅助的信号放大策略
阳离子特异性DNAzymes，一类功能性核酸，因良好的稳定性、易制备、设计灵活、可循环催化含有核糖核酸碱基rA的DNA底物在rA处裂解成两段[34]，常被用作一种理想的生物催化剂来构建灵敏的非酶分析方法[35-37]。Cai等[38]人通过结合Hg2+诱导激活的Mg2+特异性DNAzyme(Mg2+-DNAzyme)用于信号放大，提出了一种高灵敏度检测Hg2+的电化学阻抗生物传感器，并验证了其在实际样品分析中具有应用潜力。如图5所示，图中A部分首先合成了两种分别修饰DNA发夹H3和H4的共聚物链P1和P2；
图中B部分将Hg2+作为触发器，在T-Hg2+-T作用下使得D1与D2链互补结合形成特定序列的DNAzyme。Mg2+帮助下，DNAzyme选择性地结合底物H2并在rA处发生裂解作用输出sDNA片段。值得强调的是，少量的Hg2+输入虽只能激活少量的DNAzyme，但DNAzyme对H2的裂解作用循环持续发生，可以输出大量的sDNA，以进一步与电极表面固载的H1杂交，从而触发P1和P2中发夹DNA之间的HCR，在电极表面组装形成一层DNA水凝胶。总的来说，Hg2+的输入经DNAzyme作用产生大量的sDNA，sDNA触发HCR得到非导电DNA水凝胶，非导电DNA水凝胶极大地阻碍了电子转移，为构建检测Hg2+的高灵敏阻抗生物传感器提供了可能。在最佳条件下，该阻抗型生物传感器在 0.1 pmoL/L～10 nmoL/L 的浓度范围内对Hg2+具有良好的响应，检测限为 0.042 pmoL/L。
图5 基于DNAzyme辅助放大信号的传感器示意图
2.4 催化发夹自组装
催化发夹自组装(CHA)是一种焓驱动的无酶放大技术。与HCR类似，典型的CHA[39]设计了一对互补的DNA发夹(H1和H2)，但互补的碱基部分被锁定在各自的发夹结构中。如图6所示，当没有启动链存在时，H1和H2的反应在动力学上受限，以发夹的状态稳定存在。启动链存在时，启动链与H1的粘性末端和茎部碱基互补，触发DNA链置换反应打开H1的茎部，H1新裸露的单链DNA区域继续与H2的黏性末端和茎部碱基互补触发第二次链置换反应。在第二次链置换过程中，H1与H2从发夹结构已经被转化为H1/H2互补双链，启动链同时也被置换下来继续催化H1与H2的下一轮杂交。简而言之，启动链的输入加速了两个DNA发夹之间的杂交，转化为大量H1/H2互补双链输出，该过程即为CHA。
图6 CHA的工作原理
将目标核酸作为启动链激活CHA已经提出了许多灵敏的核酸检测方法[40-42]。为了设计一个Hg2+响应型CHA，Zhong等[43]人引入了Helper DNA和三个发夹探针，H1探针两端用硫醇基修饰，H2和H3用Fc标记。将Hg2+引入体系时，在T-Hg2+-T作用驱动下，Helper DNA打开H1，被打开的H1裸露部分充当启动链诱导发夹H2和H3的催化自组装，形成刚性DNA三角结构，同时释放出Hg2+。释放出的Hg2+继续调控CHA循环发生，扩增出大量DNA三角结构。输出的DNA三角结构容易与电极接触，将Fc引入电极表面产生放大的电化学信号，实现对Hg2+的灵敏检测，检测下限低至 0.12 pmoL/L。
3.1 纳米开关
DNA纳米机器具有相对较高的稳定性、灵活的可编程性和良好的生物相容性而被广泛应用。基于不同的寡核苷酸结构已经设计出了功能多样的DNA纳米器件，比如，依据T-Hg2+-T结构调控的DNA构象转换，研究人员将富T碱基的适体链作为分子开关构建了一个超灵敏控制释放型适体传感器[44]。适体链为单链时，是分子开关的关闭状态。随着Hg2+的引入，T-Hg2+-T结构的形成使得适配体弯曲成发夹结构，分子开关被打开，产生与Hg2+的浓度呈正相关电信号响应，实现了对Hg2+的超灵敏定量检测。
此外，Ma等[45]人利用DNA三向连接结构提出了另一种DNA纳米开关。如图7所示，DNA纳米开关由两个相邻但不连续的Watson-Crick碱基配对双茎与一个序列特定的DNA配体识别域共同组成。DNA配体识别域位于双茎中间，能够捕获分析物Hg2+。通过凝胶电泳分析，随着识别域中T-Hg2+-T结构逐渐形成，双茎与DNA配体识别域之间的三向连接处会
图7 基于纳米开关的传感器示意图
发生细微的构象变化使得DNA纳米开关被激活，实现开(电导率增强)与关(电导率抑制)。这种“开”和“关”双响应的固定化DNA开关能被nmoL/L水平的Hg2+激活，将其用于电化学传感器中对Hg2+具有灵敏的定量分析能力。
3.2 “蟹爪”状DNA纳米机器
Chang等[46]人巧妙设计了一种简洁高效的“蟹爪”状DNA纳米机器作为信号放大器，用于Hg2+超灵敏电化学分析。如图8所示，在目标Hg2+存在下，通过T-Hg2+-T作用调控四条DNA链(A、B、C和D)可快速简洁地自组装成“蟹爪”状DNA纳米机器，一个“蟹爪”状DNA纳米机器具备四个DNAzyme。Mg2+辅助下，该DNA纳米机器可以同时触发四个相同的DNAzyme循环裂解底物反应，将目标Hg2+的输入显著转化为大量标记有Fc的DNA片段(H1’-Fc)，提高了检测灵敏度。因此，该“蟹爪”状DNA纳米机器经巧妙设计被赋予的强大DNAzyme循环裂解作用辅助电化学传感平台实现了在 10 fmoL/L～100 nmoL/L 范围内对Hg2+简单而快速的定量检测，为金属污染物分析和环境监测系统中DNA纳米机器的开发利用提供了参考。
图8 “蟹爪”状DNA纳米机器的工作原理
典型的Hg2+电化学生物传感器的相关信息总结于表1中。可以看出，基于T-Hg2+-T结构构建的简单电化学生物传感器已经呈现出对Hg2+的高选择性响应能力；
而Exo-Ⅲ辅助Hg2+循环放大策略、HCR、DNAzyme辅助信号放大、CHA等核酸信号放大策略以及纳米机器的采用则更是明显拓宽了Hg2+电化学生物传感器的线性响应范围，检测下限低至pmoL/L级，实现了对Hg2+的灵敏检测。
表1 不同汞离子电化学生物传感器对比表
综上所述，通过集成酶辅助Hg2+循环放大策略、杂交链式反应、DNAzyme辅助信号放大、催化发夹自组装等核酸信号放大策略和新型DNA纳米机器,电化学生物传感平台的检测灵敏度已经明显提升，推动Hg2+定量分析取得巨大进展。但在实际应用中，Hg2+电化学生物传感器仍然存在部分问题亟需解决：1)传感器生物敏感元件的适用条件较窄，酸碱度及温度偏离最优条件都会产生影响；
2)检测功能单一，很少有传感器在满足Hg2+检测需求的同时可以同步检测其他种类离子；
3)实际样品如肉类、蔬菜、水果、谷物等的前处理流程还需要规范和简化。若处理不当，残留的样品杂质会直接干扰传感器对Hg2+的信号响应，造成传感器检测性能严重下降。因此，我们仍需在提升和优化电化学生物传感器的抗干扰能力方面进行努力以增强其实时现场分析能力。未来更加高效、功能多样化的纳米器件的设计与制备将是一个新的研究方向，有助于拓宽电化学生物传感器的适用范围，实现多种离子的同步检测，应对更加复杂的实际样品。
