斜率比法测定水蛭抗凝血活性的实验室间联合验证方法学

胡宇驰，肖斯婷，杨文良，郭玉东，许华玉，高 华，张 媛，唐黎明，张素慧，朴晋华，王婷婷，张 蕻，芮 菁，华晓东，侯 娟，杨天骄，李 波

(1.北京市药品检验研究院，国家药品监督管理局创新药物安全研究与评价重点实验室，中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206；
2.国家药典委员会，北京 100061；
3.中国食品药品检定研究院，北京 102629；
4.上海市食品药品检验研究院，上海 200233；
5.山西省食品药品检验所，太原 030001；
6.天津市药品检验研究院，天津 300070)

水蛭是典型的活血化瘀药物，收载入《中国药典》，其功能主治为破血通经、逐瘀消癥[1]。已有的研究结果证明，水蛭的药理作用有抗凝血、抗血栓形成、抑制血小板聚集、改善血液流变学、促进纤溶等，抗凝血是其主要的作用[2]。部分凝血活酶时间(APTT)的缩短是很多疾病的典型指标，尤其是血瘀证相关疾病，血液呈现高凝状态的血栓性疾病，如心肌梗塞、脑血管病变、肺梗死、深静脉血栓形成、妊娠高血压综合症和肾病综合症等[3]。已有的研究结果证实，水蛭具有缩短APTT的作用，整体动物试验和离体试验具有规律的一致性[4]。

本课题组经过研究证实，离体兔血浆中加入水蛭浸提液，浸提液浓度与APTT值的对数呈现直线关系，符合斜率比法测定的统计模型的要求，几批药材的预测定表明方法可行，初步证明斜率比法是适宜的测定水蛭抗凝血活性的生物检定方法[5]。本文为进一步的方法学验证研究。通过多家实验室测定，进一步证明方法的科学性、适宜性和可行性，总结实验中的注意事项，并比较斜率比法和《中国药典》2020年版中收载的凝血酶滴定法的差异。

1.1 参加联合验证的实验室在国家药典委员会的组织下，由北京市药品检验研究院经前期研究后提出标准操作规程，统一提供药品，北京市药品检验研究院、中国食品药品检定研究院、天津市药品检验研究院、山西省食品药品检验所和上海市食品药品检验研究院共5家实验室按统一的规程进行验证试验。各单位将试验原始记录、数据计算和试验报告进行整理，复印件统一提交，数据统一进行计算。

1.2 验证用药品蚂蟥饮片，由北京康而福药业有限公司提供3批，批号分别为：20171201、20171202、20171203。采用冰冻粉碎机粉碎成100目碎末。日本医蛭药材，由贵州信邦制药股份有限公司提供4批，批号分别为：20171001、20171002、20170902、20170901，已由提供单位冻干粉碎。脉血康胶囊9批，由生产企业提供或由市场购置。蚂蟥对照药材，批号：121061-201806，购自中国食品药品检定研究院。菲牛蛭对照药材，批号：121754-201901，购自中国食品药品检定研究院。协作验证用由北京市药品检验研究院统一提供给5家实验室。

1.3 仪器和APTT试剂全自动血液凝固分析仪，包括ACLELTTE PRO和ACLELTTE 700等型号，Instrumentation Laboratory Company等单位生产，APTT试剂，由Instrumentation Laboratory Co等仪器实验公司生产，批号：N0394780等。枸橼酸钠，购自北京化学试剂公司等。凝血酶、纤维蛋白原等，血凝仪及APTT测定试剂等，均由参与单位使用本单位的仪器设备和试剂。

1.4 动物及血浆日本大耳白家兔，5家实验室各自使用自己实验室的动物。家兔颈总动脉取血，3.2%枸橼酸钠1 ∶9抗凝，2 500 r·min-1离心15 min制备血浆，将多只(3只以上)兔血浆混匀，备用。

1.5 浸提液制备取水蛭对照药材，精密称定，加入0.9%氯化钠注射液(1 g ∶10 mL比例)，混匀，4 ℃浸提30 min，低温高速离心(4 ℃，5 000 r·min-1)制备上清液。吸取上清液，用0.9%的氯化钠注射液稀释成5、10、15 g·L-1浓度溶液(加0点，4个浓度成等差数列)，适当时候可稀释成其他适宜的等差系列浓度溶液(如7、14、2或10、20、30 g·L-1)。水蛭药材脉血康胶囊，精密称取药材粉末或胶囊内容物，与对照药材同法制备相同浓度的浸提溶液。

1.6 APTT测定与活性计算取活化部分凝血活酶时间(APTT)测定样品杯若干，每管依次加入一种浓度的标准品或供试品溶液20 μL(空白对照为0.9%氯化钠溶液)，兔血浆50 μL，APTT试剂50 μL，混匀，应避免产生气泡，37 ℃±0.5 ℃预温180 s，每管再加入CaCl2试剂50 μL，然后立即用血液凝固分析仪测定凝结时间，即APTT值。标准品或供试品稀释液每个浓度的测定次数不得少于2次，各浓度的测定次数应相同。测定时，血浆、标准品或供试品稀释溶液、APTT试剂、CaCl2试剂的预温时间可根据仪器或试剂的说明书适当调整，或加样后按仪器使用说明书进行测定。测定顺序应保证标准品和供试品的平行性，尽量保证相同浓度的标准品和供试品稀释液的测定时间接近。测定中建议使用空白、S1、S2、S3、T1、T2、T3，空白、T1、T2、T3、S1、S2、S3的顺序进行测定。将测得的APTT值换算成对数，照斜率比法计算方法计算供试品抗凝血活性及实验误差。试验的可靠性判定应成立，本法的可信限率(FL%)不得大于15%。

1.7 相对准确度、精密度、线性范围研究取蚂蟥对照药材和菲牛蛭对照药材，分别称取0.64、0.8、1.0、1.25、1.56 g，加入10 mL氯化钠注射液制备浸提液，均按估计效价100%与对照药材，按照斜率比法测定水蛭抗凝血活性标准草案进行试验。即5个待测溶液的相对效价水平分别为64%、80%、100%、125%和156%，在对数尺度上呈均匀间隔。每个效价水平由4家不同的实验室进行相对效价测定，每家实验室独立得到2个测定值，共8个测定值按《中国药典》2020年版附录通则9401“生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则”进行统计计算。

相对准确度可接受标准：每个效价水平相对效价测定值的相对偏差应在±20%范围内；
以效价理论值的对数(横坐标)对其相应的效价测定值的对数(纵坐标)作直线回归，回归方程的斜率应在0.80～1.25范围内。中间精密度可接受标准：每个效价水平相对效价测定值的几何变异系数(GCV，%)应不大于20%。

线性范围：相对准确度、中间精密度符合要求时的效价水平范围，质量标准中可能出现效价的范围应该在线性范围内。

1.8 样品测定验证采用蚂蟥对照药材，对3批蚂蟥饮片在5家实验室进行单独测定，计算不同实验室测定结果的精密度。采用菲牛蛭对照药材，对4批日本医蛭饮片在5家实验室进行单独测定，计算不同实验室测定结果的精密度。采用菲牛蛭对照药材，对9批脉血康胶囊在5家实验室进行单独测定，计算不同实验室测定结果的精密度。采用《中国药典》2020年版中收载的凝血酶滴定法，各家实验室对3批蚂蟥饮片、4批日本医蛭饮片、9批脉血康胶囊、蚂蟥对照药材和菲牛蛭对照药材进行抗凝血酶效价测定。样品测定结果，统计5家实验室的平均值和标准偏差，计算RSD%。

2.1 实验室对照药材测定抗凝血活性结果依照验证方案，由4家参加协作验证的单位，分别采用组织单位准备的同一批蚂蟥对照药材和菲牛蛭对照药材，在相对效价水平分别为64%、80%、100%、125%和156%，每家单位各测定两个数据，要求是不同人员、不同仪器或不同日期。收到协作验证的各单位数据后，将蚂蟥对照药材和菲牛蛭对照药材的8个数据列表，见Tab 1、2，并将测定值按《中国药典》2020年版附录通则9401“生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则”进行统计计算。各家实验室的典型数据统计示意图见Fig 1～4。

2.2 相对准确度计算5个效价水平相对效价测定值的相对偏差及其置信区间，见Tab 3、4。

Fig 1 Typical data diagram of slope ratio method for

Fig 2 Typical data of slope ratio method for collaborative

Fig 3 Typical data of slope ratio method for collaborative

Tab 1 Slope ratio method of leeches anticoagulant activity titer determination combined verification test results

Tab 2 Results of slope ratio method and verification of anticoagulant activity titer of phanthrene leeches

Tab 3 Relative deviation of anticoagulant activity of leeches control herbs with different titer levels

Tab 4 Relative deviation of anticoagulant activity of phenanthrene leeches with different titer levels

蚂蟥对照药材测定相对偏差均在±20%范围内，以效价理论值的对数(横坐标)对其相应的效价测定值的对数(纵坐标)作直线回归，回归方程为Y=0.986 1X+0.001 9，R2=0.959 1。斜率0.986 1在0.8～1.25,见Fig 5。

Fig 5 Logarithmic linear regression diagram of theoretical value and measured value of anticoagulant activity of leeches by slope ratio method

菲牛蛭对照药材测定相对偏差均在±20%范围内，以效价理论值的对数(横坐标)对其相应的效价测定值的对数(纵坐标)作直线回归，回归方程为Y=0.980 9X-0.014 2，R2=0.964。斜率0.980 9在0.8～1.25，见Fig 6。

Fig 6 Logarithm linear regression diagram of theoretical and measured anticoagulant activity titer of phenanthrene leeches by slope ratio method

2.3 中间精密度按中间精密度评价方法项下计算公式计算每个效价水平相对效价测定值的几何标准偏差、GCV及其置信上限，见Tab 5、6。

Tab 5 Calculation results of intermediate precision of

Tab 6 Calculation results of intermediate precision

蚂蟥对照药材的GCV均<20%。菲牛蛭对照药材的GCV均<20%。说明在不同人员、不同仪器、不同日期、不同血浆等，多家实验室测定的中间精密度均符合要求。

2.4 线性范围以效价理论值的对数(横坐标)对其相应的效价测定值的对数(纵坐标)作图，采用最小二乘法进行线性回归，见Fig 5、6。

蚂蟥对照药材拟合的直线回归方程为Y=0.986 1X+0.001 9，相关系数为0.979 3。表明在64%～156%，都能够进行准确测定，线性范围符合要求。

菲牛蛭对照药材拟合的直线回归方程为Y=0.980 9X-0.014 2，相关系数为0.981 8。表明在64%～156%，都能够进行准确测定，线性范围符合要求。

2.5 样品测定结果采用蚂蟥对照药材，对3批蚂蟥饮片在5家实验室进行斜率比法测定抗凝血活性，测定结果见Tab 7，同时采用《中国药典》中收载凝血酶滴定法测定活性，结果见Tab 8。从测定结果可以看出，3批蚂蟥饮片相对于蚂蟥对照药材来说，活性为99.5%、94.7%和100.4%，说明抗凝血效果与蚂蟥对照药材基本相似。进行重复测定，3批蚂蟥饮片的RSD%分别为13.9%、15.6%和9.9%，均<20%，说明样品测定在多家实验室接测定结果基本一致，重复性较好。

采用菲牛蛭对照药材，对4批日本医蛭饮片在不同天进行重复测定，测定结果见Tab 9，同时采用《中国药典》中收载凝血酶滴定法测定活性，结果见Tab 10。从测定结果可以看出，4批日本医蛭饮片相对于菲牛蛭对照药材来说，抗凝血活性在79.4%、80.6%、127.8%和135.2%，4批日本医蛭的抗凝血活性差异较大。不同实验室之间，测定结果的RSD%分别为15.4%、9.4%、13.5%和12.5%，均<20%，说明不同实验室之间对同一样品测定重复性较好。凝血酶滴定法测定日本医蛭饮片，测定结果均>16.0 U·g-1符合《中国药典》的规定。但凝血酶滴定法多家实验室测定结果之间差异较大，包括对照药材和饮片，RSD%均>50%，最高达78%；
从测定结果一致性来看，斜率比法是优于凝血酶滴定法的。

选择菲牛蛭对照药材为标准品，采用斜率比法测定9批脉血康胶囊的抗凝血活性，结果见Tab 11。同时采用《中国药典》中收载凝血酶滴定法测定活性，见Tab 12。

从测定结果可以看出，9批脉血康胶囊相对于菲牛蛭对照药材来说，抗凝血活性在14%～36%，试验均成立，5家实验室测定结果RSD%均<20%，斜率比法测定抗凝血活性适用于脉血康胶囊。凝血酶滴定法测定9批脉血康胶囊，多家实验室测定结果之间差异较大，RSD%均>50%，最高达68%；
从测定结果一致性来看，斜率比法是优于凝血酶滴定法的。

中药生物活性质量控制的关键是实验误差的控制，需要在多家实验室进行方法的重现并得到基本一致的测定结果，这是目前中药生物活性测定研究的难点，也是方法建立过程中必须进行的一个步骤[6-7]。《中国药典》2020年版的通则9105“中药生物活性测定指导原则”中，对实验室间的方法学验证仅有原则性规定，未见实操性的详细内容。本文考虑到斜率比法测定水蛭抗凝血活性是量化测定、采用样品和对照品比较的方法，因而参照通则9401“生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则”来制定验证方案，为中药生物活性测定方法的实验室间联合验证提供一个可供参考的实例[8-12]。

Tab 7 Results of slope ratio method for determination of anticoagulant activity of leeches prepared slices

Tab 8 Results of thrombin titration for determination of the activity of leeches decoction pieces combined with verification

Tab 9 Results of slope ratio method for determination of anticoagulant activity of Japanese medical leeches decoction pieces

Tab 10 Results of thrombin titration for determination of activity of Japanese medical leeches decoction pieces combined with verification

Tab 11 Results of slope ratio method for determination of anticoagulant activity of Maixuekang capsules

Tab 12 Activity of Maixuekang capsules determined by thrombin titration

(1)方法的准确度。采用蚂蟥和菲牛蛭对照药材，设置5个相对水平值64%、80%、100%、125%、156%，4家实验室测定的相对偏差均<±20%，效价理论值对数(横坐标)和对应的效价测定值对数(纵坐标)呈现明显的直线关系，相关系数>0.95，斜率在0.95～1.05，说明方法的准确度较好。

(2)中间精密度。采用对照药材经5家实验室间方法学考察，不同人员、不同仪器、不同日期、不同血浆等，各效价水平的GCV均≤20%，说明方法的中间精密度符合要求。采用多批次的饮片和脉血康制剂，多家实验室之间的RSD%均<20%，也说明本法的精密度较好。5家实验室之间，不同的仪器、人员、试剂等，测定药材和制剂，结果均较为一致，证明了斜率比法测定水蛭抗凝血活性的方法的结果是可以重现性。

(3)线性范围。从本次验证的结果来看，当测定样品的活性在对照品的64%～156%时，均可认为所测得的结果真实、可信；
如果样品的活性测定低于对照品的64%或高于156%时，应重新估计样品的活性再次测定。

(4)方法之间的比较。凝血酶滴定法因滴定终点肉眼判定，未设对照消除误差，测定值是离散型函数，导致结果的相对误差大。与之相比，斜率比法是仪器自动判定结果、对照药材消除误差、结果是连续型函数，客观性和准确性都更好，是一种更加科学的方法。

(5)方法的适宜性。经5家实验室验证，斜率比法适用于蚂蟥、日本医蛭等不同基源的药材测定，也适用于脉血康制剂的测定，具有很好的推广性。

综上，斜率比法测定水蛭的抗凝血活性，方法准确、精密、稳定，符合方法学验证的要求，可作为潜在的药典方法，用于水蛭药材和相关制剂的质量控制。

猜你喜欢 抗凝血蚂蟥凝血酶 心舒宝片活血化瘀功效的有效物质辨识研究世界中医药(2022年7期)2022-06-02澳大利亚抗凝血类杀鼠剂的非靶标影响与管控世界农药(2022年5期)2022-06-01马尾藻海藻多糖生物活性研究新进展现代农业科技(2019年12期)2019-08-07蚂蟥小学生优秀作文(趣味阅读)(2018年3期)2018-11-30基于稀土离子介导石墨烯量子点荧光开关的凝血酶生物传感器分析化学(2017年12期)2017-12-25好恐怖，被蚂蟥咬了学苑创造·B版(2017年5期)2017-05-13多肽自组装膜用于凝血酶的检测分析化学(2014年7期)2014-12-13羊血凝血酶制备条件优化食品工业科技(2014年5期)2014-03-11抗凝静脉血放置时间对血常规检测结果的影响中国实用医药(2009年13期)2009-07-15蚂蟥逃跑的秘密作文周刊·小学三年级版(2004年13期)2004-04-15 相关热词搜索：斜率，水蛭，活性，