木薯成熟种茎多倍体诱导及鉴定

摘 要 以木薯品种SC205和新选048的成熟种茎为材料，利用秋水仙素对侧芽进行滴液法处理诱导多倍体，使用流式细胞仪鉴定木薯植株倍性，并通过形态学、解剖学、生理学方法鉴定和分析多倍体、嵌合体和二倍体特征特性。结果表明：通过诱变处理获得了木薯四倍体和嵌合体植株，四倍体和嵌合体植株与二倍体相比表现出最上部全展叶第1和第2叶叶形指数降低、叶片厚度增加，气孔密度变小，叶绿体数目增加，气孔长度、保卫细胞长度和宽度增大，叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量、叶绿素总量、SPAD值增高，净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率增大。

关键词 木薯；成熟种茎；秋水仙素；四倍体；嵌合体；流式细胞仪

中图分类号 S533 文献标识码 A

Abstract Taken the mature stems of cassava“SC205”and“XinXuan 048”as the explants， the method of inducing polyploid with colchicine treated in the mature stem buds by dripping was investigated. The ploidy of the mutants were explored with flow cytometry； and the morphological， the cytological and physiological characters of the diploid， tetraploid and chimeras were identified too. The tetraploid and chimeras obtained through induction， compared to the diploid， the top two fully expanded leaves of the tetraploid and chimeras were wider and thicker， with smaller stomatal density， increase of the number of chloroplasts， the width of stomata and guard cell， chlorophyll a， chlorophyll b， carotenoid content， total chlorophyll and SPAD values， and the increase of the net photosynthetic rate， stomatal conductance， intercellular CO2 concentration and transpiration rate.

Key words Cassava； Mature stems； Colchicine； Tetraploid； Cytochimeras； Flow cytometry

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.018

木薯（Manihot esculenta Crantz）为大戟科木薯属，是三大薯类作物之一，热区第三大粮食作物，在我国主要分布于广西、广东、海南、云南、福建等热带、亚热带地区。木薯用途广泛，可食用、饲用和加工成各种工业原料，如淀粉、变性淀粉、酒精等，广泛应用于食品、医药、纺织、造纸、生物质能源等诸多行业。生产上高产稳产木薯品种缺乏、单产低、比较经济效益低、加工原料短缺已成为制约广西木薯产业发展的主要因素，高产稳产木薯品种选育显得尤为必要。多倍体育种为木薯品种选育提供了一个重要途径[1]。木薯多为二倍体，染色体数目为2n=36[2]，木薯是收获营养器官（地下块根）、以成熟种茎作为繁殖材料的无性繁殖作物，获得的多倍体常表现出明显优势，且可通过无性繁殖直接选择固定[3]。

人工诱导植物多倍体的方法有生物学、物理和化学方法。其中，秋水仙素处理加倍染色体的方法由于诱变作用专一性强、突变广谱、经济方便，目前应用最为普遍。秋水仙素诱导多倍体可分为田间诱导和离体诱导，而田间诱导处理方法主要有浸渍法[4]、滴液法[5]和注射法[6]，离体培养诱导处理方法主要有点滴法[7]、浸泡法和混培法[8]。国外对木薯多倍体的研究较早，1941年Graner[9]使用秋水仙素诱导木薯多倍体，鉴定到染色体数目为72条的四倍体材料，其中气孔的平均长度为40 μm，而对照为28 μm。2006年Nassar[10]使用0.2%的秋水仙素溶液连续3次，每次间隔12 h，对包裹棉花的木薯腋芽进行处理，筛选获得了木薯多倍体植株。在国内，早在1985年就有以甜种木薯6068为材料，采用混合化学诱变方法获得稳定的四倍体突变新品种的报道，四倍体新品种具有抗叶斑病、长势旺、杆粗、结薯集中、早熟等特点，比对照品种增产30%～60%，干薯淀粉含量比对照高2.6%[11]。陈显双等[5]采用田间诱导方法，以4 g/L的秋水仙素，滴液法处理木薯植株腋芽生长点，获得变异枝条。王建岭[4]将木薯种茎出芽到芽长2 cm左右时的木薯嫩芽浸泡在装有秋水仙素溶液的小离心管中进行诱导处理，张健[8]对木薯离体培养材料的带芽茎段、成熟子叶和丛生芽，用秋水仙素浸泡法和混培法诱导多倍体，均发现染色体加倍现象。

本研究采用不同浓度秋水仙素对木薯成熟种茎侧芽进行棉花包裹滴液法处理，经形态学鉴定筛选变异芽以及多次截顶促进侧芽萌发法进行嵌合体分离，获得诱变材料，使用流式细胞仪鉴定植株倍性，并通过形态学、解剖学、生理学方法鉴定和分析木薯多倍体、嵌合体和二倍体的特征特性。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为木薯品种SC205和新选048的成熟种茎，试验材料种植于广西农业科学院经济作物研究所木薯试验基地。

1.2 方法

1.2.1 秋水仙素诱导多倍体试验 2013年4月，将2个品种的木薯成熟种茎截成15～20 cm长的茎段，竖直扦插于塑料大棚内珍珠岩基质上，扦插深度7～10 cm。5 d后选择优良的、刚萌发的芽点用棉花包裹，并用配置好的秋水仙素溶液进行滴液法处理，处理浓度分别为0（对照）、3、6、9 g/L，处理次数为2次，时间间隔12 h，第一次于下午6点进行。试验采用随机区组设计，每个品种4个处理，每个处理3个重复，每个重复15株，每株2个芽。

1.2.2 变异植株的形态学鉴定及形态学变异植株的统计 2013年5月，对试验材料根据叶片颜色、叶脉、叶形指数、叶片质地等进行形态学鉴定，将叶片颜色加深、叶脉明显、叶形指数变小、叶片质地增厚等多倍体特征较明显的植株确定为初步变异植株，初步统计形态学变异植株数。清除无变异植株和抹除无变异芽，并采用多次截顶促进侧芽萌发法[3]分离初步变异植株。2013年7月，将形态学观察到叶片表型仍然保持较明显多倍体特征的植株移栽到大田种植，继续分离纯化变异植株，将形态学表现多倍体特征明显且稳定的植株确定为形态学变异植株，统计形态学变异植株数。

1.2.3 变异植株的流式细胞仪鉴定 2013年9月，选择大田种植后多倍体特征表现较为明显且稳定的植株，参照Pfosser等[12]的方法，采集0.2 g未展开嫩叶，经裂解、过滤、染色后，使用美国贝克曼公司生产的流式细胞仪（Cell. Lab. Quanta. SC.）测定样品细胞中DNA含量。根据DNA含量分布图中峰值所在的相对荧光强度值判断植株倍性：仅在相对荧光强度值约为在200的位置出现1个单峰，表明此植株为二倍体植株；仅在相对荧光强度值约为400的位置出现1个单峰，表明此植株为四倍体；在相对荧光强度值200～400的位置出现2个峰，表明此植株为嵌合体。

1.2.4 多倍体的形态学、解剖学和生理指标鉴定

2013年10月，从形态学、解剖学、生理学等方面对经流式细胞仪鉴定所获得的四倍体、嵌合体、二倍体进行如下鉴定分析：测量最上部完全展开叶第1和第2叶裂叶长度、裂叶宽度（与主脉垂直的叶片最宽处）、叶厚（打孔测量10片叶厚度）；参考张健[8]的研究方法对气孔保卫细胞形态进行细胞学鉴定；采用95%乙醇提取法[13]测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素及叶绿素总含量；在晴天9 ： 00～11 ： 30采用LI-6400光合测定仪测定对照株及多倍体植株叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、蒸腾速率（E）；采用便携式叶绿素仪SPAD-502PLUS测量叶片SPAD值。

1.3 统计分析

采用EXCEL、SPSS 18.0软件对试验数据进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 木薯成熟种茎腋芽经秋水仙素处理后获得的形态学变异情况

成熟种茎腋芽经秋水仙素处理后，可观察到部分萌发生长后的植株叶片发生了变异。如图1所示，SC205和新选048的变异叶片（B、D）与对照（A、C）相比，主要表现出叶片颜色加深、叶脉明显、叶片长宽比变小、叶片质地增厚等。

秋水仙素诱导多倍体试验共处理SC205、新选048成熟种茎腋芽720个，获得初步变异植株167株。其中，SC205的4个处理浓度0、3、6、9 g/L分别获得初步变异植株0、43、22、18株，诱变率分别为0.0%、47.8%、24.5%、20.0%；新选048的4个处理浓度0、3、6、9 g/L分别获得初步变异植株0、40、25、19株，诱变率分别为0.0%、44.4%、27.8%、21.1%。经初步筛选和分离纯化，将叶片表型多倍体特征仍较明显的76株材料移栽到大田种植，其中SC205的3、6、9 g/L处理浓度分别获得植株17、20、6株，新选048的3、6、9 g/L处理浓度分别获得植株10、17、6株。大田种植后继续分离纯化变异植株，获得形态学观察多倍体特征表现较为明显且稳定的SC205诱变材料7份、新选048诱变材料6份，将此13份诱变材料及2个品种的对照（二倍体）植株，用于流式细胞仪鉴定。

2.2 变异植株的流式细胞仪鉴定

将大田中经形态学鉴定为多倍体的7株SC205变异植株进行流式细胞仪倍性鉴定，其中SC205有1株在相对荧光强度值约为400的位置仅出现1个单峰（见图2-S1），表明其为纯合四倍体；有2株在相对荧光强度值200～400的位置出现2个峰（见图2-S2），表明这2株为嵌合体；其他4株在相对荧光强度值约为200的位置仅出现1个单峰（见图2-S3），表明这4株均为二倍体。将大田中经形态学鉴定为多倍体的6株新选048变异植株进行流式细胞仪倍性鉴定；其中有3株在相对荧光强度值200～400的位置出现2个峰，说明这3株为嵌合体（见图2-X1、X2）；其他3株在相对荧光强度值约为在200的位置仅出现1个单峰，说明这3株为二倍体（见图-X3）。

2.3 多倍体的形态学、解剖学和生理指标鉴定

2.3.1 形态学鉴定 由表1可知，SC205四倍体、嵌合体植株最上部完全展开叶第1叶的叶形指数分别为（4.73±3.46）和（3.64±0.64），第2叶的叶形指数分别为（4.54±1.85）和（3.62±0.77），显著小于二倍体第1、第2叶叶形指数（9.23±0.40）、（9.33±0.55）。新选048嵌合体植株X1最上部完全展开叶第1、2叶的叶形指数（2.41±0.59）、（2.16±0.01）和嵌合体X2第2叶叶形指数（2.95±0.40）分别显著小于二倍体第1、2叶叶形指数（3.76±0.33）、（3.84±0.12）；X2第1叶叶形指数（3.10±0.32）小于二倍体第1叶叶形指数但差异不显著。S1、S2的叶厚值分别达到（1.52±0.15）、（1.50±0.16） mm，显著大于二倍体S3的叶厚值（1.29±0.07） mm；X1的叶厚值为（1.39±0.05） mm，大于二倍体（1.33±0.05） mm但差异不显著，X2叶厚值为（1.58±0.09） mm，显著大于二倍体叶厚值。

由此可见，2个品种的四倍体和嵌合体植株与二倍体相比，第1、2叶叶形指数降低，叶厚增加。

2.3.2 解剖学鉴定 由表2可知，SC205四倍体S1、嵌合体S2的气孔密度分别为（18.1±3.5）、（18.1±1.2） 个/视野，二倍体S3的气孔密度为（24.3±2.6）个/视野；新选048嵌合体X1、X2气孔密度分别为（15.7±2.5）、（16.9±1.9） 个/视野，二倍体X3的气孔密度为（20.9±1.8） 个/视野。四倍体、嵌合体及二倍体叶片下表皮的气孔形态如图3所示，SC205四倍体、嵌合体的气孔密度显著小于二倍体（图3-S1、S2、S3），新选048嵌合体的气孔密度显著小于二倍体（图3-X1、X2、X3）。

SC205四倍体S1、嵌合体S2的气孔长度分别为（12.13±2.53）、（12.15±1.80） μm，气孔宽度分别为（12.13±2.53）、（12.15±1.80） μm，叶绿体数分别为（7.8±2.0）、（6.2±0.8） 个/保卫细胞，显著大于二倍体S3的气孔长度（9.22±1.56） μm、气孔宽度（2.22±0.47） μm和叶绿体数（5.1±0.6） 个/保卫细胞；S2保卫细胞长度（22.77±1.76） μm显著大于S3保卫细胞长度（20.23±2.38） μm；S1保卫细胞宽度（5.10±0.56） μm显著大于S3保卫细胞宽度（4.26±0.58） μm。新选048嵌合体X1、X2的气孔长度（11.44±2.40）、（11.64±2.39） μm大于二倍体X3气孔长度（10.90±1.87） μm，差异不显著；X1、X2的保卫细胞长度分别为（21.23±2.78）、（22.38±2.48） μm，显著大于X3的保卫细胞长度（19.15±1.95） μm。四倍体、嵌合体及二倍体叶片下表皮保卫细胞和叶绿体形态如图4所示，四倍体的叶绿体数明显多于嵌合体和二倍体（见图4-S1、S2、S3），嵌合体的保卫细胞长度明显大于二倍体（见图4-X1、X2、X3）。

由此可见，2个品种的四倍体和嵌合体植株与二倍体相比，气孔密度变小，气孔长度、保卫细胞长度和宽度增加，叶绿体数目增加。

2.3.3 生理指标鉴定 由表3可知，SC205四倍体S1、嵌合体S2的叶绿素a含量分别为（3.04±0.21）、（3.04±0.07） mg/g，叶绿素b含量分别为（0.97±0.07）、（0.97±0.04） mg/g，类胡萝卜素含量分别为（0.57±0.03）、（0.56±0.02） mg/g，叶绿素总量分别为（4.00±0.28）、（4.01±0.11） mg/g，SPAD值分别为（57.43±1.96）、（51.43±1.97），均显著高于二倍体S3的叶绿素a含量（2.17±0.09） mg/g、叶绿素b含量（0.58±0.02） mg/g、类胡萝卜素含量（0.45±0.02） mg/g、叶绿素总量（2.74±0.11） mg/g、SPAD值（42.27±0.72）。新选048嵌合体X1的叶绿素a含量（2.69±0.17） mg/g、叶绿素b含量（0.74±0.06） mg/g、叶绿素总量（3.44±0.22） mg/g、SPAD值（46.27±1.46）大于二倍体X3的叶绿素a含量（2.46±0.05） mg/g、叶绿素b含量（0.70±0.02） mg/g、叶绿素总量（3.17±0.07） mg/g、SPAD值（40.70±2.08），差异均不显著；X1类胡萝卜素含量（0.63±0.06） mg/g显著大于X3类胡萝卜素含量（0.52±0.01） mg/g；嵌合体X2的叶绿素a含量（3.28±0.19） mg/g、叶绿素b含量（0.89±0.04） mg/g、类胡萝卜素含量（0.64±0.05） mg/g、叶绿素总量（4.17±0.23） mg/g均显著大于二倍体X3，SPAD值（48.33±5.39）大于二倍体但差异不显著。

由此可见，2个品种的四倍体和嵌合体植株与二倍体相比，叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量、叶绿素总量、SPAD值均增加。

由表4可知，SC205四倍体S1的气孔导度为（0.34±0.09） μmol/（m2·s）、胞间CO2浓度为（252.40±11.45） μmol/mol 、蒸腾速率为（4.40±0.52） μmol/（m2·s），显著高于二倍体S3的气孔导度（0.22±0.08） μmol/（m2·s）、胞间CO2浓度（229.75±13.82） μmol/mol、蒸腾速率（3.32±0.84） μmol/（m2·s）；S1的净光合速率（20.29±2.67） μmol/（m2·s）高于S3的净光合速率（16.31±3.90） μmol/m2·s，差异不显著；嵌合体S2的4项光合生理指标平均值均高于二倍体，差异不显著。4项光合生理指标平均值表现为S1（四倍体）>S2（嵌合体）>S3（二倍体）。

3 讨论与结论

秋水仙素诱导产生的同源多倍体常伴随植物形态、解剖、生理、栽培特性等方面改变，如叶片变厚变大、叶色加深、叶绿素含量增加、花变大、果实变大、维管束变大、抗逆性增强、生物量或生物有效成分增加等[14-15]。本研究结果表明，四倍体、嵌合体植株与二倍体相比，表现出最上部全展叶第1和第2叶叶形指数降低、叶厚增大，气孔密度变小，叶绿体数目增加，气孔长度、保卫细胞长度和宽度增大，叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总量增高的特点，与安飞飞[16]、张健[8]、王建岭[4]等在木薯多倍体鉴定试验中的研究结果一致。另外，紫锥菊四倍体与对照二倍体相比，气孔、花粉、花和种子更大，菊苣酸、绿原酸含量明显增加[17]，董娟等[18]发现大叶铁线莲四倍体比二倍体植株叶片SPAD值增大，祁传磊等[19]发现大青杨三倍体的最大净光合速率比二倍体高出21%，而本试验的研究结果也说明了四倍体和嵌合体植株与二倍体相比，生物有效成分增加、光合特性增强。

通过流式细胞仪检查细胞核DNA含量可用于植物倍性鉴定，它不仅可以准确的测定细胞是否进行了染色体加倍，还可测定出染色体加倍和未加倍的细胞数比例[20-21]，如X1中四倍体细胞与二倍体细胞数量比约为11 ∶ 5，X2中四倍体细胞与二倍体细胞数量比约为4 ∶ 5，因此，2个嵌合体植株的四倍体细胞所占比例X1大于X2。经流式细胞仪检测，如检测结果显示是四倍体，检测得到的应是纯合的四倍体植株，而检测结果显示为嵌合体或二倍体时，则需要继续进行嵌合体分离。就无性繁殖作物而言，嵌合体分离通常采用两种方式：组织连续切割分离法和叶片不定芽再生技术[22]。王娜等[23]利用组织连续切割分离法对嵌合体进行3～4次的继代分离，获得了同质多倍体，有效防止了回复突变。秋水仙素离体诱导积雪草组培苗获得的倍性嵌合体经过不同代数培养被逐渐分离出来[24]。笔者下一步将继续对嵌合体材料分离纯化，一方面继续采用多次截顶促侧芽萌发法在田间进行，另一方面通过采集嵌合体侧芽进行离体培养，将组培苗中观察到的变异株进行连续继代增殖，进而分离获得纯合率高的木薯多倍体植株。另外，还需继续种植获得的四倍体植株，并对其综合性状进行鉴定评价，进而筛选高产高淀粉含量的木薯新品系。

致 谢 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所冷青云助理研究员提供了流式细胞仪鉴定方面的宝贵经验和建议，在此表示感谢！

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