猪圆环病毒2型单管巢式PCR检测方法建立
时间：2023-02-14 16:55:08 来源：千叶帆 本文已影响人
夏嘉鑫，岳丰雄，林 艳
（成都天邦生物制品有限公司，四川 成都 610100）
猪圆环病毒（PCV）是1974年Tischer等在PK-15传代细胞系中发现的，属于圆环病毒科圆环病毒属[1]。血清型有猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2），病毒粒子大小为14～25 nm，呈对称的二十面体，为无囊膜单股环状负链DNA病毒，是目前已知最小的动物病毒，PCV2基因组全长1 768 bp或1 767 bp[2]。
近年来的研究表明，猪圆环病毒在我国广泛流行，为了及时控制该病，减少猪圆环病毒病带来的损失，生产中急需一种快速、准确的诊断方法。目前检测PCV2抗原的分子生物学检测方法包括聚合酶链反应、巢式PCR技术（Nested PCR,nPCR）、实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR, QPCR）等。
聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）是1983年由美国研究人员发明的，利用DNA的天然复制过程，对DNA片段短时间内进行数百万倍扩增，再利用核酸电泳跑胶并染色的方式于紫外下观察，从而检出核酸含量极少的样品，但其精确度依旧不是太高，无法应对现有的检测要求。实时荧光定量PCR技术是通过荧光标记探针或添加荧光染料进行定量功能检测，能够对病毒核酸进行精确定量，弥补了普通PCR定性检测的不足，但其检测成本和要求比较高[3]。
巢式PCR检测首先使用外引物首次PCR，第1轮低循环数（10～20个）的作用是增加自然DNA模板量，以产生足够数量的合成模板供第2轮使用，放大后的产品在第2轮循环中作为模板。通常情况下，与单轮PCR相比，nPCR是一种非常敏感的检测方法，可以检测极低拷贝数的靶DNA。在特异性方面，与单轮PCR相比，nPCR减少了产生非特异性产物的可能性，而单轮PCR具有较高的循环数（40个循环），这是因为nPCR在第1轮产生的错误引物非特异性序列扩增率非常低，因为这些非特异性序列不包含内引物的结合位点[4]。
虽然nPCR技术由于其优越的性能已经检测了各种微生物制剂，但它容易受到污染和人为因素的影响。这些问题主要是由于第1轮扩增材料在移液过程中产生的污染，从而为第2轮制备模板[5]。为了克服这一问题，我们开发了一种改进的nPCR检测方法，即两轮扩增在同一试管中进行，在第1轮后不需要打开PCR管，该体系被命名为单管巢式PCR[6]。单管巢式PCR的成功在很大程度上依赖于两套引物之间的干扰最小化。
该干扰最小化是通过设计两套不同退火温度的引物来实现的。通常，第1轮是在较高的退火温度（高温轮）下进行的，并使用相对较高的熔化温度（Tm）的外引物。第2轮（低温轮）在较低的退火温度下进行，使用具有较低Tm的内（嵌套）引物来扩增第1轮产生的扩增子的内部片段[7-9]。
1.1 试验时间与地点
相关试验于2021年4月1—23日在成都天邦生物制品有限公司研发部实验室完成。
1.2 受试材料与试剂
猪圆环病毒2型DBN-SX07株、ZJ/c毒株为成都天邦生物制品有限公司研发部实验室保存；
DNA核酸提取试剂盒[TIANGEN生化科技（北京）有限公司-DP304]；
2×Taq PCR Mastermix、DL 2 000 DNA Marker均购自天根生化科技（北京）有限公司；
KAPA PROBE FAST Universal（KAPA BIOSYSTEMS/REF:KK4702 07959818001）。
1.3 主要仪器
PCR仪[Nexus gradient（艾本德）]；
荧光定量PCR仪（applied biosystems/QuantStudio3）；
琼脂糖水平电泳仪（北京六一生物科技有限公司，DYCP-31BN型）；
微量分光光度计NanoPhotometer-N60系列（德国IMPLEN）。
1.4 单管巢式PCR引物设计与合成
外引物根据国家标准GB/T 21674—2008猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法合成，引物序列详见表1。内引物根据GenBank中登录的PCV2全基因序列（登录号：MW268739.1）使用DNAStar软件的MegAlign程序进行比对，利用软件Primer 6.0及外引物序列设计出一对内引物，引物序列详见表1，参考引物设计原理，并结合单管巢式PCR引物设计要求：一般外引物退火温度高于内引物10 ℃左右。QPCRPCV2特异性引物探针按照参考文献Yu-Liang Huang合成，引物探针序列详见表1[10]。引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表1 引物信息
1.5 单管巢式PCR检测体系的建立及条件优化
为了得到理想的单管巢式PCR检测体系，首先需要DBN-SX07株、ZJ/c毒株DNA核酸模板，并开展内外引物退火温度的单因素试验，在此基础上进行内外引物浓度、Ex Taq酶用量等关键因素的正交试验。
1.5.1 猪圆环病毒2型DBN-SX07株、ZJ/c毒株DNA核酸模板制备 用TIANGEN公司的DNA核酸提取试剂盒提取猪圆环病毒2型DBN-SX07株、ZJ/c毒株基因组DNA，具体步骤参考使用说明书。
1.5.2 内外引物最佳退火温度的单因素试验 为了优化圆环单管巢式PCR的内外引物最佳退火温度，在其他因素不变的情况下，先对内引物退火温度设定62 ℃、61.4 ℃、60.3 ℃、58.2 ℃、55.6 ℃、53.6 ℃、52.2 ℃、51.5 ℃共计8个温度梯度，筛选出最佳内引物退火温度后，在此基础上对外引物退火温度设定68 ℃、66.4 ℃、64.4 ℃、62 ℃、60 ℃、58 ℃共计6个温度梯度。从中筛选出高于内引物最佳退火温度大约10 ℃的外引物作为最佳退火温度。
圆环内引物PCR扩增采用20 μL反应体系：ddH2O 7 μL，2×Taq PCR Mastermix 10 μL，10 μmol/L正反向引物各1 μL，模板DNA 1 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性45 s，以梯度温度退火1 min，72 ℃延伸25 s，30个循环；
72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
圆环外引物PCR扩增采用25 μL反应体系：ddH2O 8 μL，2×Taq PCR Mastermix 12.5μL，10 μmol/L正反向引物各1 μL，模板DNA 2.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，以梯度温度退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；
72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
1.5.3 单管巢式PCR反应体系正交试验 在单因素试验的基础上，对单管巢式PCR反应体系的3个因素（内外引物，2×Taq酶）各设定4个水平（表2），选用正交表L16（45）设计试验（表3）。各试验总体积为25 μL，每个试验均加入DNA模板2.5 μL，其他成分按照正交设计的浓度或用量加入，以ddH2O补足25 μL。PCR反应第1轮：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，外引物最佳退火温度退火30 s，72 ℃延伸1 min，20个循环，72 ℃延伸10 min；
第2轮：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，内引物最佳退火温度退火30 s，72 ℃延伸25 s，40个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳（40 min），于凝胶成像仪观察并拍照。
表2 单管巢式PCR反应体系正交试验的各因素及水平
表3 单管巢式PCR不同因素和水平的L16（45）正交试验设计
1.5.4 特异性分析 利用上述优化后的条件进行单管巢式PCR检测。以猪圆环病毒2型DBN-SX07株为阳性对照，以ddH2O为阴性对照，其他样品以如下易感猪源病毒的基因组DNA或cDNA为模板：猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪肺炎支原体（MHP）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV），扩增产物进行电泳，观察有无条带以及条带是否单一，从而判定该检测引物对的特异性。
1.6 单管巢式PCR检测体系与实时荧光PCR检测灵敏度对比分析
利用超微量核酸蛋白测定仪将猪圆环病毒2型DBN-SX07株、ZJ/c毒株DNA初始浓度采用浓度梯度稀释法稀释为0.6 ng/μL、60 pg/μL、6 pg/μL、0.6 pg/μL、60 fg/μL、6 fg/μL、0.6 fg/μL、60 ag/μL、6 ag/μL、0.6 ag/μL；
以ddH2O作为阴性对照，分别进行普通巢式PCR和单管巢式PCR检测、实时荧光PCR检测。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像仪观察并拍照，实时荧光PCR记录到达平台期的CT循环数。
2.1 最佳退火温度的筛选
为了确定单管巢式PCR内外引物的退火温度，首先在对内引物PCV2-1/2进行梯度退火温度筛选。结果显示，在供试的8个梯度退火温度中，在51.5～62 ℃共8个梯度均出现扩增条带（图1），且特异性很好，考虑到外引物最佳退火温度及单管巢式PCR内外引物退火要求，本研究选取54.4 ℃为最佳内引物退火温度开展后续试验。对外引物PCV2-P1/P3进行梯度退火温度筛选。结果显示，在供试的6个梯度退火温度中，在58～66.4 ℃共5个梯度均出现扩增条带（图2），在62～66.4 ℃非特异性条带浅，根据上述结果，考虑到内引物最佳退火温度及单管巢式PCR内外引物退火要求，本研究选取64.4 ℃为最佳外引物退火温度开展后续试验。
图1 内引物最佳退火温度确定
图2 外引物最佳退火温度确定
2.2 单管巢式PCR检测体系筛选
由于单管巢式PCR以第1轮PCR产物为模板进行扩增，可通过控制外引物用量使外引物耗尽而停止有效扩增。为此，利用SPSS软件对内外引物浓度、2×Taq酶关键因素进行正交试验设计，以筛选出最佳组合。结果显示，在16种组合中，只有组合8的扩增条带单一且清晰且非特异性几乎没有，即当外引物浓度为2 μmol/L、内引物浓度为100 μmol/L、2×Taq酶为10 μL，反应条带最清晰（图3）。综上所述，本研究建立的猪圆环病毒2型单管巢式 PCR反应体系为：ddH2O 10.1 μL，2×Taq酶10 μL，10 μmol/L外引物PCV2-P1/P3各0.2 μL，100 μmol/L外引物PCV2-1/2各1 μL，模板DNA 2.5 μL；
第1轮反应程序：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，64.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20个循环；
72 ℃延伸10 min；
第2轮反应程序：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，54.4 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸25 s，40个循环；
72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
图3 单管巢式PCR正交试验
2.3 单管巢式PCR检测体系的特异性分析
利用所建立的单管巢式PCR检测体系，对猪圆环病毒2型DNA、猪源易感染病毒共计8份样品进行单管巢式PCR扩增，以检测该体系的特异性。结果显示，只有猪圆环病毒2型DNA出现目的条带，其余病毒DNA均未检测出条带（图4）。上述结果表明，所建立的猪圆环病毒2型单管巢式PCR检测体系具有良好的特异性。
图4 单管巢式PCR特异性试验
2.4 灵敏度对比分析
将猪圆环病毒2型DBN-SX07株、ZJ/c毒株的DNA浓度调整至0.6 ng/μL，吸光度测定结果显示，OD260/OD280为1.8～1.9，OD260/OD230大于2.0。以10倍梯度进行稀释作为模板，进行普通PCR的灵敏度检测和单管巢式PCR以及实时荧光PCR检测。
普通PCR检测结果显示，当DBN-SX07株DNA模板浓度为0.6～60 fg/μL时，均检测出目的条带，但有非特异扩增；
当ZJ/c毒株DNA模板浓度为0.6～60 pg/μL范围时，均检测出单一的目的条带（图5）。
图5 外引物灵敏度试验
单管巢式PCR检测结果显示，当DBN-SX07株DNA模板浓度为0.6 ng/μL至0.6 fg/μL范围时，均检测出目的条带；
当ZJ/c毒株DNA模板浓度为0.6 ng/μL～0.6 pg/μL范围时，均检测出单一清晰的目的条带（图6）。
图6 单管巢式PCR灵敏度优化试验
实时荧光PCR检测结果显示，当DBN-SX07株DNA模板浓度为0.6 ng/μL～6 ag/μL范围时，均有特异性曲线扩增且检测出CT值；
当ZJ/c毒株DNA模板浓度为0.6 ng/μL～6 fg/μL范围时，均有特异性曲线扩增且检测出CT值，因此，针对圆环病毒2型所建立的单管巢式PCR检测对DBN-SX07株的最低限为0.6 fg/μL，ZJ/c毒株的最低限为0.6 pg/μL；
而普通PCR对DBN-SX07株的最低限为60 fg/μL，ZJ/c毒株的最低限为60 pg/μL；
实时荧光PCR对DBN-SX07株的最低限为6 ag/μL，ZJ/c毒株的最低限为6 fg/μL。
目前PCR技术的优点是敏感、特异、快速、准确，是进行病原检测和定型的常用方法。而多重PCR、巢氏PCR、定量竞争PCR的出现使得PCR技术的应用更为广泛。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的病因之一。由于病毒粒子很小、在细胞培养过程中不产生细胞病变，常规的病毒分离鉴定方法很难鉴定该病毒。由于PCV2是DNA病毒，易于抽提核酸，并从核酸水平对病毒进行检测和研究。PCR方法可以快速准确检测感染病例组织样品中的PCV2核酸，该方法敏感、特异，是检测PCV2和实验室诊断猪圆环病毒病的有效手段。Larochelle等构建了多重PCR检测方法来检测和鉴定长期感染PK15细胞的猪圆环病毒（PCV1）和引起PMWS的PCV2[11]。
本研究通过建立一种单管巢式PCR检测方法，单管巢式PCR是在一个管中加入2对引物进行2次扩增，比常规的巢式PCR减少了反应时间和操作步骤，而且减少了污染的可能性。影响单管巢式PCR成功率的因素主要有引物浓度、dNTPs浓度、引物设计、Ex Taq酶用量和温度设置等。其中引物浓度配比和退火温度又是最为关键的因素[12]。很多学者都对PCR检测方法进行了大量的研究，他们扩增的目的片段大小不一样，建立的PCR都有很好的特异性和重复性，只是灵敏度不一样。唐万寿等扩增目的片段为493 bp，检测出目的基因的最低DNA模板量为1×10-4ng[13]；
郑玉姝等扩增目的片段为482 bp，检测出目的基因的最低DNA模板量为1×10-4ng[14]。
与实时荧光定量PCR方法相比，李雪峰等建立的QPCR方法检测出目的基因的最低DNA模板量102.0TCID50/mL，比普通PCR方法高100倍[15]；
李晓菲等建立的QPCR方法检测出目的基因的最低DNA模板量5.0×101拷贝/μL，比普通PCR方法高100倍[16]；
石林等建立的QPCR方法检测出目的基因的最低DNA模板量8.828×101拷贝/μL[17]；
通过本试验建立的圆环病毒2型单管巢式PCR检测方法对易感猪源病毒不敏感，针对猪圆环病毒2型特异性强，扩增目的片段为353 bp，检测出DBNSX07株目的基因的最低DNA模板量为1×10-6ng，检测出ZJ/c毒株目的基因的最低DNA模板量为1×10-3ng，灵敏度比普通PCR高10倍，但比实时荧光定量PCR低10倍。
不同于传统的巢式PCR中途需开盖的方式，单管巢氏PCR可一步将所有试剂均一次性加入PCR单管中，在高浓度的内引物及低浓度的外引物作用下，先一步扩增出外引物扩增产物，再在扩增产物及内引物基础上扩增目的片段产物，既保证了PCR的灵敏性，也避免PCR扩增产生的气溶胶污染第2轮的PCR扩增。相比于实时荧光PCR检测，灵敏性有所不足，但考虑到实时荧光PCR检测较常规检测试剂及仪器设备太昂贵，同时检验过程中易出现假阳性的现象，单管巢氏PCR在样品的实际检测过程中，仍具有很大的应用价值。
本研究设计的单管巢式PCR具有很好的灵敏性和特异性，可用于猪圆环病毒2型（PCV2）的核酸检测。
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