基于TLR4介导的信号通路探讨人参皂苷Rg1抗脑缺血再灌注损伤的作用
时间：2023-02-15 17:30:08 来源：千叶帆 本文已影响人
马雪飞 冯冬军 于文霞 谭明 刘跃 翟凤国
脑卒中（Cerebral stroke）是一种急性脑血管疾病。据推算，我国脑卒中患者约为1 300万，而缺血性脑卒中占脑卒中人数的70%以上[1，2]。静脉化学溶栓是目前治疗缺血性脑卒中的主要治疗手段之一，然而，通过溶栓治疗恢复血流量会损害脑组织，造成脑缺血再灌注（I/R）损伤。目前脑I/R损伤的作用机制尚不明确，但炎症反应是脑I/R损伤发病过程中的关键部分，有研究指出，减少炎症因子的分泌或加强抗炎因子的表达可以缩小脑I/R损伤大鼠脑梗死体积，有助于神经功能恢复[3]。Toll样受体4（TLR4）作为Toll样受体识别系统，是一个参与固有免疫反应的模式识别受体蛋白，MyD88是TLR4介导炎症通路重要的胞内接头蛋白，可以募集下游信号分子的N端死亡结构域（Death domain,DD）和承接TLRs活化信号的C端TIR结构域，NF-κB是TLR4/MyD88下游的重要节点，参与转录调控，可导致炎症因子释放[4]。人参皂苷Rg1是人参的主要提取物之一，有研究发现，人参皂苷Rg1可以通过激活Nrf 2/ARE信号通路，减小脑I/R损伤大鼠的脑梗死体积[5]；
也有研究表明，人参皂苷Rg1可以通过激活PPARγ/HO-1信号通路缓解脑I/R损伤大鼠神经元凋亡[6]。但关于人参皂苷Rg1是否通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥脑保护作用的研究较少。本研究通过建立脑I/R损伤大鼠模型，比较不同剂量的人参皂苷Rg1对脑I/R损伤大鼠的影响，为进一步探讨人参皂苷Rg1对大鼠脑I/R损伤的保护作用提供理论依据。
1.1 实验动物 6～8周SPF级SD（Sprague Dawley）大鼠60只，重量为250～300g，来自牡丹江医学院比较医学中心，动物许可证号为SYXK（黑）2019-006。大鼠自由获取食物和水，室温25℃恒定，模拟昼夜光照，在牡丹江医学院比较医学中心饲养（SCXK2019-003）。严格按照中国实验动物管理法规处理动物,实验中所有动物严格遵循3R原则。
1.2 试剂 人参皂苷Rg1购自上海源叶生物技术有限公司；
大鼠白细胞介素1β（IL-1β）、大鼠白细胞介素6 （IL-6）、大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、ELISA试剂盒、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master mix、ECL化学发光底物试剂盒均购自北京华诺德生物科技有限公司；
一抗TLR4、MyD88、NF-κB、β-actin、山羊抗兔二抗等以上抗体均购自上海优宁维生物科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 实验分组、给药及模型的建立 将SD大鼠随机分为4组：假手术组、脑I/R损伤模型组、低剂量给药组（人参皂苷Rg1 30mg/kg）及高剂量给药组（人参皂苷Rg1 60mg/kg），各15只。假手术组与脑I/R损伤模型组分别于术前每天1次腹腔内注射生理盐水，低、高剂量给药组每天1次腹腔内注射人参皂苷Rg1，连续给药5天。末次给药30min后，采用颈内动脉线栓法致大鼠大脑中动脉阻塞引起脑I/R损伤模型，即在大鼠颈正中部做切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪1个“V”形切口，将事先准备好的尼龙线栓轻轻插入颈内动脉18～20mm处，当感到有明显阻力时，提示线栓已经栓在中动脉起始部位，达到阻塞动脉，即停止插栓线。阻闭90min后，将线栓缓慢拔出，恢复再灌注24h，形成大鼠脑I/R损伤。假手术组只暴露血管、缝合，不进行任何其他操作。
1.3.2 各组大鼠运动神经功能缺损评分比较 待脑I/R损伤24h后，观察大鼠的精神状态，根据Longa等[7]的评分标准对各组大鼠进行评分，0分：无神经系统损伤症状，活动正常；
1分：提尾时，左前肢屈曲；
2分：行走时身体向左侧转圈；
3分：向左侧倾倒；
4分：不能自发行走，意识丧失。各组大鼠运动神经功能缺损评分分值越高，提示大鼠神经功能障碍越严重，取1～3分大鼠用于后续实验。
1.3.3 炎症因子水平检测 按照ELISA检测试剂盒说明书中的操作步骤进行实验操作。分别检测各组大鼠血浆IL-1β、IL-6、TNF-α水平。
1.3.4 qRT-PCR法检测大鼠皮层脑组织中TLR4的表达 取各组大鼠的皮层脑组织样本约100mg，提取皮层脑组织中总RNA，用超微量核酸蛋白测定仪测定RNA浓度。将提取的RNA逆转录成cDNA，经SYBR Green荧光染色法对各组大鼠皮层脑组织中TLR4 mRNA的表达情况进行测定。内参选取β-actin，以2-ΔΔCt法来对TLR4 mRNA表达情况进行计算。实验中的所有引物均由英潍捷基上海贸易有限公司合成，TLR4基因的引物序列（5"-3"）为F:CTAGTCGACGAGATGGCGCTGCAT,R:CGCGGATCC ACTACAACAGGCAGATCAAC；
β-actin基因的引物序列（5"-3"）为F:GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA，R:GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG。
1.3.5 Western blot检测大鼠皮层脑组织中各目的蛋白水平的表达 取各组皮层脑组织样本约100mg，加入0.2ml预冷的蛋白裂解缓冲液（RIPA组织-细胞快速裂解液∶蛋白磷酸酶抑制剂=100∶1），用研磨棒在冰上充分研磨，4℃摇床充分裂解30min，4℃12 000r/min离心15min，吸取上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组总蛋白的浓度。按照15μl上样量含有40μg蛋白样品进行SDSPAGE电泳，湿法电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h后，分别加入MyD88（兔抗大鼠1∶500稀释）、NF-κB（兔抗大鼠1∶1 000稀释）、TLR4（兔抗大鼠1∶300稀释）、β-actin（兔抗大鼠1∶2 000稀释）一抗4℃孵育过夜，PBST缓冲液（1 000ml PBS加入0.5ml Tween 20）洗涤3次，每次10min，加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶10 000稀释）孵育1h，PBST缓冲液洗涤3次，每次10min，最后用ECL化学发光试剂显色，化学发光成像仪曝光、取像并测定条带灰度值，各组灰度测定值与β-actin灰度值比值作为实验结果。
1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析法（One-way ANOVA），组间比较采用最小显著性差异法（LSD），P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.1 各组大鼠运动神经功能缺损评分比较 由于本实验仅选择神经功能缺损评分为1～3分的大鼠为实验对象，根据每组的实际情况，从中选择8只大鼠进行运动神经功能缺损评分的比较。脑I/R损伤模型组大鼠运动神经功能缺损评分为（2.13±0.64）分，明显高于假手术组的0分（P＜0.01）；
与脑I/R损伤模型组比较，低剂量给药组大鼠运动神经功能缺损评分为（1.38±0.52）分稍低（P＜0.05），而高剂量给药组大鼠运动神经功能缺损评分为（1.23±0.35）分明显较低（P＜0.01）。
2.2 各组大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较 在本实验中，随机从上述每组中各选6只大鼠对血浆进行TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子水平的检测。与假手术组比较，脑I/R损伤模型组大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明显较高（P＜0.01）；
与脑I/R损伤模型组相比，人参皂苷Rg1预处理的大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-1β水平随着给药剂量的增加而减少（P＜0.01），呈剂量相关。见表1。
表1 各组大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-1β水平（±s，n=6）
表1 各组大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-1β水平（±s，n=6）
注：与假手术组比较，*P＜0.01; 与脑I/R损伤模型组比较，#P＜0.01
组别 TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml） IL-1β（pg/ml）假手术组 4.51±2.53 34.75±5.83 57.07±25.85脑I/R损伤模型组 73.05±10.24* 114.69±27.02* 398.71±78.99*低剂量给药组 41.41±14.54# 25.45±6.26# 156.59±36.22#高剂量给药组 9.92±7.09# 10.04±2.47# 78.01±36.67#
2.3 各组大鼠皮层脑组织中TLR4 mRNA表达比较 与假手术组比较脑I/R损伤模型组大鼠皮层脑组织中TLR4 mRNA的表达明显升高（P＜0.01）；
与脑I/R损伤模型组比较，人参皂苷Rg1预处理的大鼠皮层脑组织中TLR4 mRNA的表达随着给药剂量的增加而减少（P＜0.01），呈剂量相关。见图1。
图1 各组大鼠皮层脑组织中TLR4 mRNA的表达
2.4 各组大鼠皮层脑组织中TLR4蛋白表达比较 与假手术组比较，脑I/R损伤模型组大鼠皮层脑组织中TLR4蛋白表达较高（P＜0.05）；
与脑I/R损伤模型组比较，低剂量给药组大鼠皮层脑组织TLR4蛋白的表达降低（P＜0.05），而高剂量给药组大鼠皮层脑组织TLR4蛋白的表达显著降低（P＜0.01），呈剂量相关。见图2。
图2 各组大鼠皮层脑组织中TLR4蛋白的表达
2.5 各组大鼠皮层脑组织中TLR4介导的通路蛋白表达比较 与假手术组比较，脑I/R损伤模型组大鼠皮层脑组织中MyD88、NF-κB蛋白的表达增加（P＜0.05）；
与脑I/R损伤模型组比较，低剂量给药组大鼠皮层脑组织中MyD88、NF-κB蛋白的表达降低（P＜0.05），而高剂量给药组大鼠皮层脑组织中MyD88、NF-κB蛋白的表达显著降低（P＜0.01），呈剂量相关。见图3。
图3 各组大鼠皮层脑组织中MyD88、NF-κB蛋白的表达
脑I/R损伤是指脑组织缺血一定时间后再恢复血液灌注，使脑组织细胞出现了损伤加重，甚至造成不可逆损伤的现象。近年，中药提取物对脑I/R损伤防治作用的相关报道越来越多[8，9]。其中人参皂苷Rg1是人参的主要活性成分之一，因具有抗氧化、抗凋亡、神经保护等药理学活性而被广泛关注[10]。本实验发现人参皂苷Rg1可以明显降低脑I/R损伤大鼠的运动神经功能缺损评分，这与相关实验结果一致[11]，提示人参皂苷Rg1有助于脑I/R损伤大鼠的神经功能恢复。脑I/R损伤病理生理机制复杂，是多种因素共同作用的结果。有研究发现通过诱导自噬，可以增加脑I/R损伤大鼠的脑含水量，减少脑梗死体积，缓解I/R损伤[12]；
也有研究发现，通过抑制神经元CA3区细胞内的钙离子，可以保护神经元免受I/R引起的脑损伤[13]。同样，炎症反应也参与脑I/R损伤过程，炎症反应是机体内白细胞和化学因子对抗损伤保护机体的过程，任何作用于机体的损伤都必将引发一系列的炎症反应。当脑I/R损伤发生时，中性粒细胞聚集在毛细血管内皮，同时破坏血脑屏障，引起脑内炎症介质的释放，加重脑损伤。而TLR4是介导脑I/R损伤的关键治疗靶点之一，TLR4是第一个Toll样受体蛋白，可以通过诱导NF-κB控制基因的表达激活适应性免疫[14]。当TLR4激活时，TLR4和MyD88通过促进肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）活化，最终导致NF-κB激活，进而诱导炎症因子的表达和释放，引起组织的进一步损伤[15～17]。TNF-α、IL-1β、IL-6是重要的炎症因子，有研究证明TNF-α、IL-1β、IL-6过度释放会加重脑I/R损伤，阻断TNF-α、IL-1β、IL-6的释放，对脑I/R损伤SD大鼠具有保护作用[18]。本研究中，通过ELISA法检测各组大鼠血浆中TNF-α、IL-6、IL-1β因子的含量发现，人参皂苷Rg1预处理过的大鼠会降低血浆中这三种炎症因子的表达，表明人参皂苷Rg1可以通过抑制炎症因子的释放发挥神经保护作用，而这种保护作用必然会涉及到相关炎症通路的改变。
TLR4/MyD88/NF-κB信号通路是一条重要的调节炎症反应的通路，有研究表明，龙胆苦苷通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，降低脑I/R损伤后的炎症反应，从而发挥抗脑I/R损伤的作用[19]；
雷帕霉素通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路降低脑I/R损伤的炎症反应，抑制脑I/R损伤诱导的神经元凋亡,防止神经元变性[20]。为了验证人参皂苷Rg1是否也能介导TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥抗脑I/R损伤的作用，我们进行qRTPCR检测各组大鼠皮层脑组织中TLR4 mRNA的表达、Western blot检测大鼠皮层脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表达。发现当脑I/R损伤发生时，大鼠皮层脑组织中TLR4 mRNA、蛋白以及MyD88、NF-κB蛋白的表达显著提高，而用人参皂苷Rg1预处理的大鼠皮层脑组织中TLR4 mRNA、蛋白以及MyD88、NF-κB蛋白的表达明显减少，且呈剂量相关，提示当脑I/R损伤发生时，人参皂苷Rg1通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子的释放，发挥神经保护作用。
综上，人参皂苷Rg1具有良好的抗脑I/R损伤的作用，其机制可能与抑制TLR4介导的MyD88/NF-κB信号通路有关。
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