TCP11基因在宫颈癌中表达的意义
时间：2023-02-17 20:35:06 来源：千叶帆 本文已影响人
王芳，王露月，付少伟，者湘漪,，李洪涛，李冬妹，潘泽民*
(1 石河子大学医学院生物化学教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832002；
2 石河子大学医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室，新疆 石河子 832002)
宫颈癌是女性妇科恶性肿瘤之一[1-2]，2018年全球新增宫颈癌病例约57万例，死亡31万例[3]。宫颈癌在我国的发病率和病死率逐渐增加，且逐渐年轻化[4-5]。人乳头瘤病毒 (human papilloma virus,HPV) 感染是宫颈癌发生的常见原因[6-7]，大部分宫颈癌是由持续性感染高危型HPV所引起的[8-9]。宫颈癌恶性程度高，转移和侵袭能力强，早期常无明显症状和体征，容易漏诊和误诊[10]。
TCP11基因是编码受精促进肽受体(FPP)小鼠TCP11基因的人类同源物[11]，定位于人染色体6p21[12]。TCP11基因在睾丸编码TCP11a，TCP11b和TCP11c 3个异构体[11]。有文献报道，子宫癌肉瘤(Uterine Carcinosarcoma，UCS)同时显示癌性和肉瘤性成分，TCP11基因的 DNA甲基化变化是其肉瘤成分的特征[13]。TCP11基因在宫颈癌中的研究尚未有文献报道。因此，本研究的目的是探讨TCP11基因在宫颈癌组织及细胞中的表达情况、与患者预后和HPV感染的关系。
1.1 细胞株与主要试剂
HaCaT、C33A细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，HeLa、SiHa细胞购自武汉博士德生物工程有限公司。主要试剂见表1。
表1 主要试剂及购买公司
1.2 数据来源
1.2.1 The Human Protein Atlas(HPA)数据库
HPA数据库是人类蛋白质表达图数据库(https://www.proteinatlas.org/)，从RNA和蛋白水平研究人类不同组织和器官中的蛋白表达情况的数据库[14]。本文利用HPA数据库分析TCP11蛋白表达高低与宫颈癌患者生存率的相关性。
1.2.2 Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)数据库
GEPIA数据库 (http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)，是由北京大学团队研究开发，利用来自TCGA和GTEx数据库的9 736个肿瘤和8 587个正常样品进行基因表达分析的数据库[15]。本文利用GEPIA数据库分析TCP11基因在宫颈癌的表达及与患者预后的关系。
1.2.3 UALCAN数据库
UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/)主要用于对癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)项目中大量的基因数据进行深入分析[16]。本文利用UALCAN数据库分析TCP11基因在宫颈癌的表达、与患者预后的关系及其启动子甲基化状态。
1.3 样本收集
收集新疆石河子大学医学院第一附属医院2017～2019年就医患者组织蜡块及其HE切片，其中正常宫颈组织31例、宫颈癌组织35例。收集患者病史资料和HC-2检测HPV感染的结果。样本的收集已得到石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会的批准及患者本人知情并签署知情同意书。
1.4 细胞培养
永生化的上皮细胞HaCaT、宫颈癌SiHa、HeLa、C33A细胞培养在含5% CO2、37 ℃培养箱中。培养基均为含FBS、1%青、链霉素的DMEM培养基，其中HaCaT细胞是含15% FBS、宫颈癌细胞是含10% FBS。间隔2～3 d传代。
1.5 方法
1.5.1 组织芯片实验
根据收集的正常宫颈组织及宫颈癌组织蜡块的HE切片，由病理科专家标记切片上正常宫颈上皮及宫颈癌上皮的部位，按照记号在组织蜡块上标记。在供体蜡块上打孔取样，再点样在受体蜡块上，从而制成组织芯片。芯片采用EnVision二步法染色，TCP11抗体稀释为1∶200，结果由病理学专家阅片判读。
1.5.2 Western blot实验
取对数生长期HaCaT、SiHa、HeLa、C33A细胞，提取细胞总蛋白。运用SDS-PAGE电泳80 V 30 min，110 V 60 min，电转110v 60 min，封闭液(5%脱脂奶粉)封闭2 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育12～14 h，洗去一抗，二抗(兔抗1∶5 000)室温孵育2 h，洗去二抗，化学发光仪曝光。
1.5.3 实时荧光定量PCR实验，
取对数生长期HaCaT、SiHa、HeLa、C33A细胞，提取细胞总RNA。每组RNA取1ug逆转录成cDNA，然后进行PCR扩增，以GAPDH为内参，扩增条件为90 ℃ 30 s,95 ℃ 30 s,60 ℃30 s,40个循环。运用2-ΔΔCt法计算TCP11基因 mRNA相对表达量。引物序列如表2所示。
表2 引物序列
1.6 统计学分析
2.1 生物信息学数据库分析宫颈癌组织中TCP11基因mRNA表达水平
运用UALCAN、GEPIA数据库分析宫颈癌组织中TCP11基因mRNA表达水平，结果显示UACLAN数据库中TCP11基因mRNA表达量的中位数在正常宫颈以及宫颈癌组织分别是0.171、2.373 每百万转录本(Transcript per million,TPM)，P<1E-12，差异有统计学意义(P<0.05，图1A)。在GEPIA数据库中，宫颈癌组织中TCP11基因 mRNA表达高于正常宫颈组织(图1B)。
图1 生物信息学数据库预测TCP11基因在宫颈癌组织中的mRNA表达(T:Tumor;N:Normal;*:P<0.05)
2.2 生物信息学数据库分析TCP11基因启动子甲基化状态
运用UALCAN数据库分析宫颈癌中TCP11基因启动子甲基化的状态，结果显示宫颈癌组织中TCP11基因启动子甲基化低于正常宫颈组织，P=7.37E-07，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。
2.3 生物信息学数据库预测TCP11基因表达与宫颈癌患者临床病理特征的相关性
利用UALCAN数据库分析TCP11基因的表达与宫颈癌患者临床病理特征之间的关系，结果发现与正常组相比，在宫颈癌患者21～40、41～60、61～80的年龄段TCP11基因的表达有差异(P<0.05)，在81～100的年龄段TCP11基因的表达无差异，而TCP11基因在宫颈癌患者的各年龄段之间的表达水平无差异(P>0.05)，见图3A。此外，TCP11基因在宫颈癌不同病理分级的表达均无差异(P>0.05)，见图3B。
Bata value:DNA甲基化水平图2 生物信息学数据库预测宫颈癌组织中TCP11基因启动子甲基化水平
2.4 生物信息学数据库预测TCP11基因表达与宫颈癌患者生存率的关系
运用UALCAN、GEPIA、HPA数据库预测分析TCP11基因表达水平与宫颈癌患者生存率的关系，其中UACLAN数据库有291例(TCP11高表达76例，TCP11低表达215例)宫颈癌患者、GEPIA数据库有292例(TCP11高表达146例，TCP11低表达146例)宫颈癌患者、HPA数据库有291例(TCP11高表达123例，TCP11低表达168例)宫颈癌患者。结果均显示，TCP11低表达与宫颈癌患者不良预后有关，而TCP11高表达反而对宫颈癌患者预后有利(图4)。
A：TCP11基因在正常及宫颈癌患者各年龄段(21-40、41-60、61-80、81-100)的相对表达水平比较；
B：TCP11基因在正常及宫颈癌不同病理分级的相对表达的比较图3 生物信息学数据库预测TCP11基因表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系
A：UACLAN数据库分析TCP11基因的表达与患者生存率的关系；
B：GEPIA数据库分析TCP11基因的表达与患者生存率的关系；
C：HPA数据库分析TCP11基因的表达与患者生存率的关系图4 生物信息学数据库预测TCP11基因表达与宫颈癌患者生存率的关系
2.5 TCP11基因在宫颈癌组织中高表达
运用组织芯片检测在正常宫颈(31例)及宫颈癌(35例)组织中TCP11基因表达水平。结果显示，与正常宫颈组织比较，TCP11基因在宫颈癌组织中高表达(图5、表3)。
图5 TCP11基因在正常宫颈及宫颈癌组织的表达
表3 TCP11基因免疫组化染色结果统计表
2.6 TCP11基因的表达与宫颈癌患者临床特征的关系
分析所收集宫颈癌组织样本的临床特征与TCP11基因表达之间的关系，结果显示TCP11基因表达可能与年龄及分化程度无关(P>0.05)，见表4。
表4 TCP11基因的表达与临床特征的关系
2.7 TCP11基因与HPV感染的关系
对所收集正常宫颈及宫颈癌组织样本的HC-2检测结果进行分析，结果显示TCP11基因的表达可能不受HPV感染的影响(P>0.05)，见表5。
表5 正常宫颈及宫颈癌组织中TCP11基因与HPV感染的关系
2.8 宫颈癌细胞TCP11蛋白质表达水平
Western blot实验表明，与永生化的上皮细胞HaCaT相比，TCP11蛋白质在宫颈癌SiHa、HeLa、C33A细胞中高表达(图6)。
图6 TCP11蛋白在永生化的上皮细胞(HaCaT)及宫颈癌细胞(SiHa、HeLa、C33A)的表达水平
2.9 宫颈癌细胞TCP11基因 mRNA表达水平
实时荧光定量PCR实验检测TCP11基因mRNA在永生化的上皮细胞HaCaT以及宫颈癌SiHa、HeLa、C33A细胞中的表达，结果表明宫颈癌细胞中TCP11基因mRNA表达水平明显高于永生化的上皮细胞HaCaT(图7)。
**：P<0.01;***：P<0.001;****：P<0.0001图7 TCP11基因在永生化的上皮细胞(HaCaT)及宫颈癌细胞(SiHa、HeLa、C33A)mRNA的表达水平
在女性恶性肿瘤中，宫颈癌的发病率和病死率位于第2位[17-18]。虽然宫颈癌的诊断和治疗策略有所改善，但是宫颈癌病死率依然很高，肿瘤侵袭和转移仍然是宫颈癌治疗的重要障碍[19]。目前，TCP11基因与肿瘤相关的研究文献较少，并且TCP11基因在宫颈癌中的作用也尚不清楚。
TCP11基因是一种睾丸特异性基因产物[11]。有文献报道，TCP11蛋白质在精子获能和顶体反应过程中发挥作用，可调节腺苷酸环化酶cAMP途径的活性[20]。在精子获能后，蛋白激酶A(PKA)依赖性信号传导途径的顶体区域内酪氨酸残基的磷酸化增加[21]。此外，TCP11基因与MAPK家族信号级联反应MAPK1/MAPK3信号传导中不依赖RAF的MAPK1/3激活的MAPK3(ERK1)激活有关。在此途径中，TCP11基因是参与 pT，Y-MAPK3：MAP2K1的解离，即是MAP2K1(MEK1)从磷酸化的MAPK3(ERK1)解离，从而使p-S202，204-MAP2K二聚化[22]；
还参与MAP2K1结合MAPK3，即是MAP2K1(也称为MEK1)将MAPK3(ERK1)上的关键Thr202和Tyr204磷酸化，从而将两个ATP转换为ADP，MAPK3的磷酸化激活其激酶活性。TCP11基因与ZNF143(锌指蛋白143)有关系，可激活硒代半胱氨酸tRNA(tRNAsec)，绑定到小核RNA(snRNA)基因启动子的SPH基序，通过其与CHD8的相互作用参与有效的U6 RNA聚合酶III转录。有文献报道，ZNF143通过PI3K/AKT信号通路促进EMT进程[23]。但是，TCP11基因对EMT相关分子是否有影响还尚不清楚，有待于研究。
通过生物信息学分析发现，TCP11基因在宫颈癌组织中高表达和启动子低甲基化。这一结果表明可能是基因启动子低甲基化，而导致TCP11基因高表达。生物信息学分析还发现，TCP11基因与宫颈癌患者的年龄和肿瘤分级无显著相关性。运用组织芯片、Western blot和实时荧光定量PCR进一步研究，发现TCP11基因在宫颈癌组织及细胞均高表达，且与患者年龄及分化程度无显著相关性。这一结果和预测结果一致，明确了TCP11基因在宫颈癌组织高表达，但其在宫颈癌发生发展中的作用机制还有待于深入研究。另外，生物信息学分析发现TCP11基因的低表达与宫颈癌患者的不良预后有关，而其高表达对患者预后有利。今后将利用细胞转染实验将TCP11基因转到宫颈癌细胞使其过表达，观察过表达TCP11基因是否表现出有利于细胞的表型结果。本研究发现TCP11蛋白质的表达可能不受HPV感染的影响，TCP11与HPV感染的关系有待深入研究。TCP11基因是否在宫颈癌细胞中具有影响转移、侵袭能力还需要进一步研究。
综上所述，TCP11基因在宫颈癌组织和细胞中高表达，其高表达可能对宫颈癌患者预后有利，这对发现宫颈癌生物标志物，为预防、治疗宫颈癌及分析宫颈癌的预后有重要的意义。
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