水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

徐媛媛，莫 霞，黄晨茜，冯 超，陆杏蓉，马小娅，杨春艳，郑海英，尚江华

(1.中国农业科学院广西水牛研究所，广西水牛遗传繁育重点实验室，南宁 530001; 2.农业农村部水牛遗传繁育技术重点实验室，南宁 530001)

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是在1975年由Carswell等[1]发现的一种能使肿瘤细胞凋亡、坏死的细胞因子。细胞凋亡是一个内在的和基本的生物学过程，在多细胞有机体的发展和组织稳态的维持中起着关键的作用[2]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是TNF超家族成员之一，是1995年由Wiley发现并命名的[3]。1996年，Pitti等[4]进一步证实并命名该分子为Apo2L。在哺乳动物中，TNF超家族成员主要包括TNF-α、Fas配体和Apo2L/TRAIL[4-6]。TRAIL通过2个不同的受体(TNFR1、TNFR2)启动不同的细胞效应，包括细胞的生长、存活、活化、增殖、分化和死亡[7-8]。TRAIL广泛表达于正常人的各种组织(肺脏、肾脏、脾脏、胸腺、前列腺、卵巢、小肠、外周淋巴细胞、心脏、胎盘、骨骼肌等)中，但在脑、肝脏和睾丸中未检测到表达[3,9-11]。TRAIL是一个促凋亡配体，其作用在多种类型的疾病中表现突出，如非小细胞肺癌[12]、骨肉瘤[13]、肝细胞癌[14]、结直肠癌[15]、肾脏疾病[16]、白血病[17]等，但对正常细胞无明显毒性。因此，关于TRAIL抗肿瘤作用的研究较多，而在动物生长发育中的作用研究甚少。Song等[18]通过体内外试验证明，NG和Apo2L联合治疗能够通过激活肿瘤组织中的细胞凋亡来抑制神经胶质瘤的生长。Zhang等[19]研究表明，TRAIL能够诱导食管鳞状细胞癌中PD-L1的表达，促进上皮-间质转化。

水牛(Bubalusbubalis)在中国南方农业产业结构中占有非常重要的地位。随着规模化养殖的逐渐发展，对水牛繁殖率的要求越来越高，但是目前中国水牛的繁殖周期长，繁殖率低于其他哺乳动物，而繁殖率的高低取决于母体卵巢卵泡的生长发育。因此，研究影响水牛卵泡发育及卵泡闭锁的因素至关重要。研究表明，颗粒细胞是卵泡晚期闭锁的最重要影响因素，卵巢颗粒细胞的凋亡影响卵泡生长、发育，而颗粒细胞的生长和凋亡受多种基因及信号通路的调控[20-22]。研究显示，TRAIL可影响猪卵泡颗粒细胞中的卵泡发育，TRAIL/DcR1(decoyreceptor-1)能够抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，闭锁卵泡颗粒细胞中TRAIL表达量显著升高，而其受体DR4蛋白水平升高不明显，TRAIL-DcR1表达量显著降低。TRAIL及其受体通过激活Caspase-3诱导颗粒细胞凋亡，而DcR1则抑制TRAIL及其受体诱导的细胞凋亡[23]。推测TRAIL及其受体可能参与水牛卵巢颗粒细胞凋亡，进而影响水牛卵泡发育。鉴于此，本研究拟对水牛TRAIL基因进行克隆及生物信息学分析，以期为探究TRAIL信号通路对水牛卵巢卵泡发育及颗粒细胞的增殖和凋亡的影响提供参考。

1.1 材料

广西本地水牛——沼泽型水牛卵巢组织样品采自广西南宁屠宰场，―80 ℃保存备用。Trizol Reagent(15596018)购自Ambion公司；
PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)、PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 plus Dye RR902A)、DL1000 DNA Marker(3591Q)、pMD18-T 载体(6011)均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；
大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物科技有限公司；
胶回收试剂盒(D2500-02)购自Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 参照NCBI上公布的水牛TRAIL基因序列(GenBank登录号：XM_006068410.4)，采用Snapgene软件设计1对用于水牛TRAIL基因CDS区序列的克隆引物，引物序列为：F：5′-ATGGGCCTGAAGCAGGCT-3′；
R：5′-GCGCTTAGCCAATTAAAAAGGCTCCG-3′。引物由擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 总RNA提取和反转录 利用Trizol法提取水牛卵巢组织总RNA，并用NanoDrop 2000检测其浓度和质量(D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0)，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。参照反转录试剂盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书将RNA反转录为cDNA，―20 ℃保存备用。

1.2.3TRAIL基因CDS区克隆及测序分析 以沼泽型水牛卵巢组织cDNA为模板进行PCR反应。PCR反应体系50 μL：上、下游引物各1.25 μL，PremixTaqTM25 μL，cDNA模板2.5 μL，ddH2O补至50 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；
72 ℃延伸5 min。取50 μL PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物经胶回收纯化后，与pMD18-T载体连接，连接体系10 μL：pMD18-T 1 μL，目的片段4 μL，Solution Ⅰ 5 μL。16 ℃金属浴连接1 h。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上37 ℃培养14 h。挑取单克隆后，将其置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中继续培养，通过菌液PCR验证后，将阳性菌液送至擎科生物科技有限公司进行双向测序。

1.2.4TRAIL基因核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对和系统进化树构建 使用DNAStar软件中MegAlign程序对水牛、牦牛(登录号：XM_005889917.2)、普通牛(登录号：NM_001319901.1)、山羊(登录号：XM_005675308.3)、绵羊(登录号：XM_004003150.5)、马(登录号：NM_001297473.1)、野猪(登录号：NM_001024696.1)、人(登录号：NM_003810.4)、黑猩猩(登录号：XM_008957310.3)和家鼠(登录号：NM_009425.2)的TRAIL基因CDS区序列进行相似性比对；
利用Mega 6.0软件构建系统进化树；
使用GENE-DOC软件对水牛、牦牛、普通牛、山羊、绵羊、马、野猪、人、黑猩猩和家鼠的TRAIL蛋白的氨基酸序列进行比对。

1.2.5 生物信息学分析 利用PortParam和PortScale在线软件分析TRAIL蛋白的理化性质、亲/疏水性；
利用TMHMM 2.0和SMART在线软件预测TRAIL蛋白的跨膜区和结构域；
利用NetPhos 3.1、NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0在线软件预测TRAIL蛋白的磷酸化位点和糖基化位点；
采用SignalIP 4.1程序和PSORT Ⅱ Prediction预测TRAIL蛋白的信号肽切割位点和亚细胞定位；
通过GORIV和SWISS-MODEL软件分别预测TRAIL蛋白的二级结构和三级结构，详细信息见表1。

表1 生物信息学分析网址Table 1 Bioinformation websites

续表

2.1 TRAIL基因CDS区克隆及序列分析

以反转录得到的水牛卵巢cDNA为模板，PCR扩增水牛TRAIL基因CDS区，结果表明，扩增出的目的条带与预期长度相符(图1)。通过测序和序列拼接得到长864 bp的水牛TRAIL基因CDS序列，编码287个氨基酸。通过NCBI在线BLAST程序比对发现，本试验克隆的水牛TRAIL基因CDS区与GenBank公布的序列(登录号：XM_006068410.4)一致，表明成功扩增水牛TRAIL基因mRNA序列。

2.2 TRAIL基因核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对及系统进化树构建

核苷酸序列比对结果显示，水牛TRAIL基因与普通牛、牦牛、绵羊、山羊、马、野猪、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.3%、99.2%、96.3%、95.9%、84.8%、84.7%、81.3%、81.3%和70.0%(图2)。通过Mega 6.0软件利用NJ(Neighbor-Jioning)法构建水牛TRAIL基因与其他物种的系统进化树，结果见图3。由图3可知，与水牛亲缘关系最近的是牦牛和普通牛，其次是山羊和绵羊，再次是野猪、马、人和黑猩猩，与家鼠的亲缘关系最远。通过氨基酸序列比对发现，水牛TRAIL蛋白氨基酸序列与牦牛、普通牛相似性极高，在不同物种间其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高(图4)。推测TRAIL蛋白功能区在不同物种间比较保守。

图1 水牛TRAIL基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification result of TRAIL gene in buffalo

图2 水牛TRAIL基因核苷酸序列相似性比对Fig.2 The similarity alignment of nucleotide sequences of TRAIL gene in buffalo

图3 TRAIL基因系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of TRAIL gene

Bb，水牛；
Bm，牦牛；
Bt，普通牛；
Ss，猪；
Ch，山羊；
Oa，绵羊；
Ec，马；
Hs，人；
Pp，黑猩猩；
Mm，家鼠 Bb,Buffalo;Bm,Bos mutus;Bt, Bos taurus;Ss,Sus scrofa;Ch,Capra hircus;Oa,Ovis aries;Ec,Equus caballus;Hs,Homo sapiens;Pp,Pan paniscus;Mm,Mus musculus图4 水牛TRAIL蛋白氨基酸序列相似性比对Fig.4 The similarity alignment of amino acid sequences of TRAIL protein in buffalo

2.3 生物信息学分析

2.3.1 理化性质和亲/疏水性分析 TRAIL蛋白分子式为C1518H2339N395O435S13，分子质量约为33 ku，原子总数为4 700，半衰期为30 h，理论等电点为8.80，脂肪系数为77.77，表示TRAIL可能为碱性蛋白质。水牛TRAIL蛋白由20种常见氨基酸组成，其中亮氨酸(9.8%)含量最高，半胱氨酸(1.4%)、组氨酸(1.4%)、色氨酸(1.4%)含量最低；
带正电荷的氨基酸残基(Arg和Lys)38个，带负电荷的氨基酸残基(Asp和Glu)33个(表2)。水牛TRAIL蛋白不稳定系数为48.36，不稳定系数>40，属于不稳定蛋白。

表2 水牛TRAIL蛋白氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of TRAIL protein in buffalo

采用PortScale在线软件分析TRAIL蛋白的亲/疏水性，预测标准为Hphob./Kyte & Doolittle，结果显示，TRAIL蛋白平均亲水性指数为―0.475，属于亲水性蛋白，最高分值(疏水性最强)出现在第21位苯丙氨酸(2.789)，最低分值(亲水性最强)出现在第207位赖氨酸(―2.856)(图5)。

图5 水牛TRAIL蛋白亲/疏水性预测Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of TRAIL protein in buffalo

2.3.2 跨膜结构和结构域分析 经TMHMM 2.0软件预测，水牛TRAIL蛋白第15―37位氨基酸处存在1个跨膜结构，即水牛TRAIL蛋白第1―14位氨基酸处为胞外区、15―37位氨基酸处为跨膜区、38―287位氨基酸处为胞内区(图6)。经SMART软件预测，水牛TRAIL肽链的胞内区具有1个TNF结构域，位于第140―285位氨基酸处(E-value=6.48e-45，图7)。

图6 水牛TRAIL蛋白跨膜区预测Fig.6 Transmembrane domain prediction of TRAIL protein in buffalo

图7 水牛TRAIL蛋白结构域预测Fig.7 Structural domain prediction of TRAIL protein in buffalo

2.3.3 磷酸化位点和糖基化位点分析 对TRAIL蛋白的氨基酸序列进行磷酸化位点预测，共发现29个磷酸化位点，包括8个苏氨酸位点、18个丝氨酸位点、3个酪氨酸位点，阈值为0.5(图8)。分别用NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0在线软件预测TRAIL蛋白糖基化位点，结果显示，水牛TRAIL蛋白不存在糖基化位点。

图8 水牛TRAIL蛋白磷酸化位点预测Fig.8 Phosphorylation site prediction of TRAIL protein in buffalo

2.3.4 信号肽切割位点和亚细胞定位分析 信号肽预测结果显示，水牛TRAIL蛋白在第32位氨基酸处C值最高(0.153)，在第16位氨基酸处Y值最高(0.211)，在第6位氨基酸处S值最高(0.551)，在1―15位氨基酸处S值平均值为0.418，说明水牛TRAIL蛋白不存在信号肽切割位点，推测其为非分泌蛋白(图9)。亚细胞定位分析结果显示，水牛TRAIL蛋白主要存在于内质网(55.6%)中，线粒体、高尔基体、细胞核和细胞质中各占11.1%，因此TRAIL蛋白位于细胞质中的可能性大于细胞核，可能性分别为88.9%和11.1%，可信度为70.6%，表明该蛋白存在于细胞质中的可能性较大。

2.3.5 二级结构和三级结构分析 使用GORIV软件预测TRAIL蛋白的二级结构，结果显示无规则卷曲(51.57%)占比最高，其次是延伸链(24.39%)，而α-螺旋(24.04%)占比最低(图10)。使用SWISS-MODEL软件同源建模，水牛TRAIL蛋白的三级结构预测模型见图11，与模板1 dg6.1(人Apo2L/TRAIL分子)的结构相似性为75.53%，GMQE值和QMEANDisCo Global值分别为0.47和0.70，可信度较高。

图9 水牛TRAIL蛋白信号肽切割位点预测Fig.9 Signal peptide cleavage site prediction of TRAIL protein in buffalo

①h，α-螺旋；
e，延伸链；
c，无规则卷曲。②线条从长到短分别为α-螺旋、延伸链、无规则卷曲 ①h,Alpha helix;e,Extended chain;c,Random coil.②The lines form long to short represent alpha helix,extended chain and random coil,respectively图10 水牛TRAIL蛋白二级结构预测Fig.10 Secondary structure prediction of TRAIL protein in buffalo

图11 水牛TRAIL蛋白三级结构预测Fig.11 Tertiary structure prediction of TRAIL protein in buffalo

目前，研究人员已对人[3-4]、蝙蝠[24]、长江江豚[25]、马[26]等哺乳动物的TRAIL基因进行了报道，且不同物种TRAIL基因CDS区长度不同，人TRAIL基因编码区为846 bp，编码281个氨基酸；
蝙蝠TRAIL基因编码区为843 bp，编码280个氨基酸；
长江江豚TRAIL基因编码区为864 bp，编码287个氨基酸；
马TRAIL基因编码区为870 bp，编码289个氨基酸。本试验成功从沼泽型水牛卵巢组织中克隆得到TRAIL基因CDS序列，目前这是通过分子克隆从水牛中得到的第1个TRAIL基因。水牛TRAIL基因编码区长864 bp，编码287个氨基酸。将水牛TRAIL基因与GenBank中其他9个物种的TRAIL基因进行相似性比对发现，其与牦牛、普通牛、山羊和绵羊的相似性达到95.9%以上，与野猪、马、人和黑猩猩的相似性达到81.3%以上，与家鼠的相似性最低，为70.0%。系统进化树结果发现，水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛进化关系最近，其次是山羊和绵羊，与家鼠的亲缘关系最远，说明该基因在不同物种间保守性存在差异，但总体来说具有较高的保守性。

TRAIL蛋白分子式为C1518H2339N395O435S13，属于碱性、亲水性蛋白且性质不稳定。通过氨基酸序列比对和理化性质预测得知，TRAIL蛋白在物种间高度保守一致。通过GeneDoc软件分析发现，水牛TRAIL蛋白与其他9个物种之间的相似性较高。表明在哺乳动物中TRAIL的氨基酸序列是比较保守的，且胞外区比胞内区和跨膜区更保守。与其他TRAIL一样，水牛TRAIL蛋白具有典型的跨膜区和TNF结构域，具有N-端非保守区，而C-端在不同物种之间具有较高的保守性。磷酸化修饰是可逆的，参与细胞信号转导等过程，水牛TRAIL蛋白含有29个磷酸化位点，推测磷酸化修饰可能与该蛋白的生理功能有关，后期针对TRAIL蛋白功能分析可以借助磷酸化位点的变化来分析其在调控颗粒细胞发育及凋亡中的作用。蛋白二级结构预测发现，无规则卷曲是水牛TRAIL蛋白最主要的结构形式，进一步证实了水牛TRAIL蛋白性质不稳定的结果，易于改变空间构象。人TRAIL蛋白的第230位半胱氨酸(Cys230)是TRAIL发挥功能所必需的，通过形成分子间二硫键诱导凋亡[27]，且Cys230的突变影响其生物活性和稳定性[28]。Gao等[29]对鳜鱼TRAIL进行了类似试验，结果显示，与对照相比，过表达突变型SCTRAIL-C203S不能诱导HeLa细胞的凋亡。Kahraman等[30]研究表明，TRAIL可通过激活Akt信号通路诱导啮齿动物胰腺β细胞的增殖。本试验中，水牛TRAIL蛋白含有3个保守的半胱氨酸残基(Cys55、Cys76、Cys236)，由于Cys236与人TRAIL中Cys230位于相同的位置，推测水牛TRAIL蛋白在介导细胞增殖与凋亡方面也发挥着重要作用。

水牛产业是广西的优势特色产业，作为一种乳肉兼用的大型经济动物，水牛以抗病性好、适应性强、耐粗饲且奶质优良等优点成为了热带、亚热带气候地区的潜在优势发展畜种。随着规模化养殖业的逐渐发展，对水牛繁殖率的要求越来越高。了解水牛卵泡发展规律及其影响因素有利于提高水牛繁殖能力，提高生产的经济效益。颗粒细胞位于卵母细胞透明带外侧，与卵母细胞相连，不仅对卵母细胞的成熟有重要影响，而且对整个卵巢的功能也作用极大。颗粒细胞和卵母细胞间的密切关系体现在颗粒细胞的增殖、分化由卵母细胞指导，反过来颗粒细胞又会为卵母细胞的成熟提供重要的营养和信号，所以颗粒细胞的状态对卵母细胞质量及胚胎发育潜能有很大的影响[31-32]。在一定条件下，它们可以直接或间接地引起卵泡闭锁。卵巢颗粒细胞凋亡包含2条途径：线粒体途径和死亡受体途径。死亡受体途径是由死亡受体和配体结合引起的，如TRAIL及其受体、Fas及其配体FasL；
线粒体途径主要由Bcl-2家族相关蛋白介导[33]。Wada等[34]研究表明，TRAIL及其受体可能在闭锁卵泡中诱导猪卵泡颗粒细胞的凋亡，且DcR1能够抑制颗粒细胞的凋亡。Inoue等[35]研究证实，TRAIL在猪卵巢卵泡闭锁期间可诱导颗粒细胞的凋亡。但是，关于TRAIL调控水牛卵巢颗粒细胞发育及凋亡的作用机制鲜见报道。因此，克隆水牛TRAIL基因CDS区序列，利用生物信息学分析其编码蛋白，不仅有助于了解水牛TRAIL基因结构与功能，还可为深入探究TRAIL蛋白对水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的影响奠定基础。

本试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS区序列，大小为864 bp，编码287个氨基酸，TRAIL蛋白分子质量约为33 ku。系统进化树结果显示，水牛与牦牛和普通牛的亲缘关系最近。TRAIL蛋白存在1个跨膜结构域，140―285位氨基酸处是TNF区，含有29个磷酸化位点，不存在糖基化位点和信号肽，是亲水性蛋白，主要存在于细胞质中，二级结构以无规则卷曲为主。

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