HPLC-CAD分析黄芪甲苷提取过程中黄芪皂苷类成分动态变化
时间：2023-02-20 23:40:04 来源：千叶帆 本文已影响人
刘蓬蓬，鞠成国，林桂梅，聂紫璇，任天航
辽宁中医药大学药学院，国家中医药管理局中药炮制工艺原理重点研究室，辽宁省中药炮制专业技术创新中心，辽宁 大连 116600
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌之功。现代研究表明，黄芪主要含有皂苷类、黄酮类和多糖类成分，具有抗菌、抗炎、增强免疫调节、抗氧化、抗疲劳、抗骨质疏松等药理作用[1-4]。
《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）自1995年版起以黄芪甲苷作为评价黄芪药材和饮片质量的指标性成分之一，且1995－2000年版《中国药典》测定黄芪甲苷的方法均采用薄层扫描法[5-6]，2005年版《中国药典》首次采用HPLC 测定黄芪甲苷含量[7]。1995－2015年版《中国药典》黄芪甲苷的基本提取步骤未发生改变，仅对个别步骤的溶液使用量进行了更改[5-9]。2015年版《中国药典》黄芪甲苷提取操作过程为：“取本品中粉约4 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 mL使溶解，放冷，通过D101 型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。”[9]该提取工作较为繁琐、耗时，2020年版《中国药典》黄芪甲苷的提取过程虽有简化，但依然保留了加入氨试液进行提取的操作[10]。
本研究根据《中国药典》方法，对黄芪甲苷提取过程的主要步骤进行拆分，分析提取过程中黄芪皂苷类成分的变化情况，为制订新的黄芪甲苷提取方法提供依据，并为黄芪药材和饮片的质量评价提供参考。
LC-20AB 高效液相色谱仪，日本岛津公司；
Corona 电雾式检测器，美国ESA 公司；
METTLER AE240型十万分之一分析天平，瑞士METTLER公司；
FA1004B型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；
YP5102 型电子天平，上海光正医疗仪器有限公司；
Milli-Q纯水仪，美国Millipore公司。
黄芪购自辽宁省朝阳市朝阳县黄芪GAP（中药材生产质量管理规范）种植基地，经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根。黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪甲苷（黄芪皂苷Ⅳ）对照品，成都曼斯特生物科技有限公司，批号分别为MUST-16012906、MUST-16031010、MUST-16022804，纯度≥98%；
正丁醇、氨水、乙醇、甲醇为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号分别为20190111、20190513、20191109、20190312；
甲醇、乙腈为色谱纯，美国Sigma公司，批号分别为193172、191839；
水为超纯水。
2.1 样品制备
取原药材，除去杂质，洗净，润透，切厚片，干燥，粉碎（过4号筛），备用。
2.2 对照品溶液制备
2.3 供试品溶液制备
2.3.1 索氏提取（A法）
取样品粉末4 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.3.2 索氏提取和正丁醇萃取（B法）
取样品粉末4 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.3.3 索氏提取和正丁醇萃取并经D101型大孔吸附树脂柱洗脱（C法）
取样品粉末4 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，残渣加水5 mL使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.3.4 索氏提取和正丁醇萃取并经氨试液洗涤（D法）
取样品粉末4 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.3.5 按药典全过程提取（E法）
老区革命纪念馆的发展一定要在发挥红色资源的同时依据当地具体情况，定位清晰，统一思想。革命纪念馆只有负重拼搏,与时俱进,红色旅游才将成为革命纪念馆更快发展的强劲推动力。
取样品粉末4 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 mL使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.4 色谱条件
采用Ecosil C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相A为纯水、B为乙腈，梯度洗脱（0.01～20 min，32%～32%B；
20～25 min，32%～40%B；
25～35 min，40～45%B；
35～45 min，45%B；
45～46 min，45%～100%B；
46～70 min，100%B；
70～71 min，100%～32%B；
71～78min，32～32%B）[11-13]，流速1.0mL/min，进样量10 μL，氮气压力35 psi，高频滤波，量程200 pA。色谱图见图1。
图1 黄芪甲苷拆分提取过程中皂苷成分HPLC图
2.5 线性关系考察
精密吸取黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪甲苷对照品溶液适量，按“2.4”项下色谱条件测定，记录峰面积。以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果3种成分线性关系良好，见表1。
表1 3种成分线性关系考察结果
2.6 精密度试验
精密吸取各对照品溶液10 μL，按“2.4”项下色谱条件，重复进样6次，测得黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪甲苷峰面积的RSD分别为0.9%、1.2%、1.1%，表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、12、24 h进样，按“2.4”项下色谱条件，测得黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪甲苷峰面积的RSD 分别为1.3%、1.7%、1.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 重复性试验
精密称取同一批样品6份，按“2.3.1”项下A法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件，测得黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪甲苷峰面积的RSD 分别为1.5%、1.9%、1.8%，表明本方法重复性良好。
2.9 加样回收率试验
取同一批已知含量的A法提取样品4 g，平行6份，精密称定，分别精密加入黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪甲苷对照品溶液适量，按“2.3.1”项下A法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪甲苷的平均回收率分别为100.5%、99.6%、101.3%，RSD分别为1.6%、2.0%、1.9%，表明该方法准确率高。
2.10 含量测定
取黄芪样品，按“2.3”项下各法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件测定黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪甲苷的含量，结果见表2。
表2 黄芪甲苷拆分提取过程中黄芪皂苷类成分含量（mg/g，n=3）
可以看出，黄芪甲苷提取过程中，黄芪皂苷Ⅰ和黄芪皂苷Ⅱ在氨试液洗涤前含量较高、黄芪甲苷含量较低，而经氨试液洗涤后，黄芪皂苷Ⅰ和黄芪皂苷Ⅱ的含量显著降低、黄芪甲苷含量显著升高。B法与A法比较，黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪甲苷在经水饱和正丁醇萃取后含量亦降低，表明水饱和正丁醇的萃取效率不高，引起的损耗较大。而C法与B法、E法与D法比较可见，黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪甲苷的含量无明显差异，表明经D101型大孔吸附树脂柱洗脱富集这一步骤可以省略。
2.11 单体转化试验
吸取氨试液适量，分别加入黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪甲苷对照品溶液中，按“2.4”项下色谱条件测定分析，色谱图见图2，黄芪皂苷类成分转化途径见图3。
图2 黄芪皂苷单体转化HPLC图
图3 黄芪皂苷类成分转化途径
可见，黄芪皂苷Ⅱ在经氨试液洗涤后会脱掉木糖基2位上的乙酰基转化生成黄芪甲苷，而黄芪皂苷Ⅰ在经氨试液洗涤后先脱掉木糖基3位上的乙酰基生成黄芪皂苷Ⅱ，再进一步转化生成黄芪甲苷。
本研究结果表明，黄芪甲苷提取过程中在经氨试液洗涤后黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ发生了量变与质变，而黄芪甲苷发生了量变，故采用经氨试液作用转化而来的黄芪甲苷数据结果进行黄芪质量评定欠妥，无法客观、真实反映黄芪中黄芪甲苷含量。本研究发现，黄芪中黄芪皂苷Ⅰ含量较高且稳定，故建议将《中国药典》黄芪项下的皂苷类成分评价指标由黄芪甲苷修订为黄芪皂苷Ⅰ较为合理。此外，本研究对拆分黄芪甲苷提取过程中的黄芪皂苷Ⅲ含量变化情况亦进行了测定分析，而黄芪皂苷Ⅲ含量未发生明显变化，表明氨试液不会引起黄芪皂苷Ⅲ变化。同样，水饱和正丁醇对黄芪皂苷Ⅲ的萃取效率亦不高，引起损耗较大。
黄芪中的皂苷类成分无紫外吸收，一般采用蒸发光散射检测器（ELSD）进行检测分析。ELSD是散射光的对数响应值与组分的质量的对数呈线性关系，但此对数关系变异性较大，且其灵敏度较低，最低检测限在50～100 ng。本研究采用的电喷雾检测器较ELSD具有更高的灵敏度，对无紫外吸收化合物的最低检测限达到1 ng，更适用于含有较弱或无紫外吸收的皂苷类成分分析[14]。
《中国药典》黄芪含量测定项下尚有另一指标性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷，但中药成分复杂，是以多成分多靶点综合发挥药效作用。黄芪中包括皂苷类成分如黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪甲苷等，以及毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、2"-羟基-3",4"-二甲氧基-异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷、7,2"-二羟基-3",4"-二甲氧基-异黄烷、9,10-二甲氧基-紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、3-羟基-9,10-二甲氧基-紫檀烷等黄酮类成分，故建议可选取上述多种成分同时作为指标性成分，通过采用HPLC技术建立黄芪饮片多成分指纹图谱和多成分含量的限定范围，对黄芪饮片质量进行整体、客观的评价，从而为临床应用、中药制剂生产提供药效稳定、质量可控的黄芪饮片。
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