湖北地区猪流行性腹泻病毒流行病学调查及N基因的序列分析
时间：2023-02-21 21:20:04 来源：千叶帆 本文已影响人
王 妍，赵润泽，谭 旭，张子微，李 桐，李春琪，郭利伟，杨小林，刘国平
（长江大学，荆州 434000）
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由冠状病毒科、冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，具有高传染性、高致病性和高死亡率特点。发病猪以厌食、水样腹泻、呕吐以及脱水为主要症状。可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越严重，死亡率越高[1]，成年猪发病较轻，但可长期隐性带毒，康复猪可持续排毒1～2个月，严重危害我国养猪业。PED发病急，传播速度快，短时间内猪场可反复发病。1971年PED首次报道于英国，之后陆续在比利时、荷兰、德国等发生与流行[2]。2010年开始，PEDV感染出现大面积暴发[3]。王颢然等[4]统计2008-2018全国18个省市地区共计6951份样本，PEDV阳性样本数3345份，阳性率为48.12%。徐丽华等[5]对2011-2017年浙江省PEDV流行情况的调查显示，PEDV的总阳性率为71.25%（389/546），年均阳性率均为50%以上。段群棚等[6]对2016-2019年广西部分猪场的PEDV阳性情况进行统计，结果显示PEDV的平均阳性率为59.74%。近几年来，猪流行性腹泻在我国各地频发，给养猪业带来巨大的损失。
PEDV为有囊膜正链RNA病毒，基因组全长为28 kb左右。PEDV可编码20种蛋白（4种结构蛋白和16种非结构蛋白）。其中N蛋白是一种与病毒基因组相关的磷酸化结构蛋白，大量存在于病毒感染的细胞中，促使RNA复制体的形成和病毒组装，促进病毒的繁殖，在诱导免疫和病毒感染的致病机制中起重要作用[7]。在早期感染PEDV时，宿主体内就能产生抗N蛋白高水平的抗体[8]，由于N蛋白高度保守，因此它是用作早期诊断试剂和疫苗开发抗原的最佳候选蛋白[9-10]。
为进一步了解中国湖北地区 PEDV的流行态势以及变异情况，本研究使用反转录PCR方法对2021年3月至2022年2月收集的来自湖北地区部分规模化养猪场的1580份出现腹泻症状的样品进行PEDV检测，对12株检测阳性样本的N基因部分序列进行扩增和测序，并对变异情况进行分析和预测，掌握PEDV在湖北地区的流行特点及变异情况，为有效防控该病提供科学依据，为研制安全、有效的PEDV疫苗提供理论依据。
1.1 临床样品收集 2021年3月-2022年2月，从湖北省部分规模化猪场收集有流行性腹泻症状病猪的粪便-肛门拭子，共计1580份，其中春季321份、夏季386份、秋季322份、冬季551份。
1.2 主要试剂和仪器 PrimeScript™One Step RT-PCR Kit Ver.2反转录试剂盒，购自宝日医生物（北京）有限公司；
琼脂糖，为Spanish公司产品；
Taq-DNA聚合酶、TS-GelRed 核酸凝胶染料、DL-2000 DNA marker，购于擎科生物科技有限公司；
AxyPrepTM Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 试剂盒，购自美国 AXYGEN公司。
1.3 样品处理及病毒RNA提取 将收集的粪便-肛门拭子样品存于5 mL无菌离心管中，加入适量的PBS缓冲液浸润棉拭子头部，涡旋振荡，置于恒温摇床上300 rpm 30 min，取上清液；
样品病毒RNA提取采用Axygen体液提取试剂盒，具体步骤参照试剂盒说明书进行。用Nanodrop1000检测所提取RNA的浓度和纯度，将RNA于-20℃保存备用。
1.4 PEDV病原学检测 采用本实验室建立的巢式RTPCR检测PEDV的方法（表1），对样品进行病原学检测。检测引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.5 数据统计与分析 对不同日龄段、不同季节的检测结果，采用SPSS 24.0卡方检验进行差异性分析，P＜0.05为差异显著。
1.6 PEDV-N基因测序与序列分析 以巢式PCR的内侧引物作为测序引物，将选出的12份PEDV的阳性PCR产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。应用DNA Star中的MegAlign软件将测序正确的PEDV-N基因序列与GenBank上发表的24条PEDV-N基因参考序列（表2）进行比对分析。利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建系统进化树。1.7 PEDV-N蛋白抗原表位预测 应用DNA Star.v7.1中的Protean软件对N蛋白抗原表位进行预测分析，对比本研究12份测序序列与经典疫苗株CV777和AJ1102的N蛋白抗原表位的差异。
2.1 临床样品的检测结果 对2021-2022年湖北地区的规模化猪场收集的1580份临床样品进行巢式 RTPCR扩增，共检测到PEDV阳性样品318份，样品总阳性率为20.13%（318/1580），图1为部分样品扩增结果。
图1 部分样品扩增结果Fig.1 Amplification results of some samples
2.1.1 不同日龄阶段 对不同日龄段猪群PEDV的感染情况进行分析（表3），0～28日龄的阳性率为40.27%（118/293)，28～70日龄的阳性率为26.89%（135/502)，70～120日龄的阳性率为10.33%（31/300)，120～270日龄的阳性率为8.07%（23/285)，大于270日龄的阳性率为5.50%（11/200）。结果表明小于70日龄猪群PEDV的检出率远高于其它日龄段，不同日龄段猪群之间PEDV检出率的差异显著（P＜0.05），表明PEDV易感群体为0～70日龄，0～28日龄猪最为严重。
表3 不同阶段样品阳性率Table3 Positive rate of samples at different stages
2.1.2 不同季节 不同季节PEDV感染情况进行分析（表4），冬季的PEDV检出率最高为36.66%（202/551），其余依次为春季19.00%（61/321）、秋季11.49%（37/322），最低为夏季4.66%（18/386），不同季节PEDV检出率差异显著（P＜0.05）。结果表明，PEDV的感染多发于冬季，春季和秋季也需加强PEDV的防控。
表4 不同季节样品阳性率Table4 Positive rate of samples in different seasons
2.2 PEDV-N基因序列测序及分析
2.2.1 PEDV-N基因的核苷酸同源性比对及分析 将本研究12份测序序列与GenBank上已发表的26株PEDV参考毒株的N基因核苷酸序列进行同源性分析，12株测序毒株之间的核苷酸同源性为94.0%～99.7%，氨基酸同源性为93.9%～100.0%；
与参考毒株N基因的核苷酸同源性为94.5%～99.8%，氨基酸同源性为94.6%～100.0%（图2、3）。利用MEGA 7.0软件中的最大似然法对38份PEDV-N基因构建系统发育进化树（图4），系统发育分析显示，PEDV-N基因可分为G1-a、G1-b、G2-a、G2-b四个亚型，本研究的12株PEDV-N序列分布于亚型G1-a、G1-b和G2-a。其中测序序列HB-1、HB-3与经典毒株CV777、Br1-87株、SM98株、LZC株均属于G1-a型；
HB-7与Ah2016/2株、HLJBY株、CV777均属于G1-b型；
另外9份测序序列均为G2-a型，该亚型还包括SD2020株、GXGG07株、AH2012株等。
图2 PEDV-N核苷酸同源性分析Fig.2 Nucleotide homology analysis of PEDV-N
图3 PEDV-N氨基酸同源性分析Fig.3 Homology analysis of amino acids of PEDV-N
图4 PEDV-N基因遗传进化分析Fig.4 Genetic evolution analysis of PEDV-N gene
2.2.2 抗原表位预测分析 通过DNAStar.v7.1中的Protean软件对N蛋白抗原表位进行预测分析（图5），用本研究12份测序序列对比经典疫苗株CV777和AJ1102的N蛋白的抗原表位差异。本研究12份测序序列与CV777和AJ1102在抗原表位上发生了较大变异，这可能使PEDV疫苗产生的抗体不能中和流行毒，从而导致免疫失败的发生。
图5 PEDV-N抗原表位预测Fig.5 Epitope prediction of PEDV-N
本研究对2021-2022年湖北地区PEDV的调查结果显示，总阳性率为20.13%（318/1580）。其中0～28 d仔猪、28～70 d保育猪、70～120 d后备猪、270 d中大猪、＞270 d猪的阳性率依次为40.27%、26.89%、10.33%、8.07%和5.50%。结果表明，0～70日龄段猪群PEDV的感染率远高于其它阶段猪群。韩英明等[12]对2016-2018年间山东省16个地区不同日龄猪群的PEDV检出情况进行统计，0～14日龄猪和14～28日龄猪PEDV检出率与其它日龄段相比差异显著（p＜0.05）；
秦世新等[13]对湘西部分猪场不同生长阶段的粪便样品进行PEDV调查分析，哺乳仔猪的阳性率接近70%，保育猪的阳性率仅次于哺乳仔猪，且与其他生长阶段的猪群阳性率差异显著。以上结果表明PEDV易感龄段为0～70 d，且0～28 d的感染情况尤为严重。
综上研究，推测0～70日龄段猪群易感原因如下：（1）＞70日龄猪群随着日龄增加可耐过PEDV，无严重的临床症状，但病猪可能持续性的排毒。通过直接或间接性的传播途径感染0～70日龄的猪群；
（2）初生仔猪主要通过摄取初乳获得母源抗体的保护，而PEDV属冠状病毒，其疫苗的保护期短，分娩母猪的抗体水平极大的影响仔猪的成活率[14-15]；
（3）断奶仔猪入群前未对猪群和环境进行PEDV的评估，健康猪与带毒猪的直接传播；
带毒猪受应激排毒污染车辆、走道、工具等间接传播，为PEDV的感染提供有利途径。
PEDV在湖北地区一年四季均有检出，其中冬季（36.66%）为PEDV的高发期，其余依次为春季19.00%和秋季11.49%，最低为夏季4.66%。分析其原因，湖北地处亚热带，降水充沛，雨热同季，春季气温多变，秋季气温下降迅速，且春、秋季的降水期较长。猪舍的温度和湿度影响着PEDV的存活状态，其存活状态与传播能力呈现正相关。冬季和雨季猪舍内环境温度低且湿度大，防寒措施的不完善，猪群受冷应激的影响加速PEDV的传播；
不利于饲料的储备，连续阴雨天气，易使饲料霉变加剧腹泻病毒的传播和发生。
N蛋白作为病毒中含量最高的结构蛋白，在病毒感染早期的猪体内就能够检测到高水平的N蛋白抗体，在病毒感染初期的实验室诊断及病毒防控和疫苗研制中具有重要的意义[16]。本研究12株PEDV-N基因序列与GenBank上登录的参考毒株相比，12株测序毒株之间的核苷酸同源性为94.0%～99.7%，氨基酸同源性为93.9%～100.0%；
与参考毒株N基因的核苷酸同源性为94.5%～99.8%，氨基酸同源性为94.6%～100.0%（图2，3）。用湖北地区12株PEDV流行毒株的N基因核苷酸序列与GenBank上发表的27条PEDV-N核苷酸序列构建系统遗传进化树（图4）；
并对比本研究获得的12株序列与经典疫苗株CV777和AJ1102的N蛋白的抗原表位差异[17]。结果显示，湖北地区12株PEDV-N序列分布于G1-a、G1-b和G2-a亚型，其中大部分属于G2-a亚型，未检出与当前流行变异毒株AJ1102同一进化分支的G2-b亚型。本研究获得的12株序列与CV777和AJ1102的抗原表位差异较大。这表明，湖北地区流行毒株与经典疫苗株CV777尤其是AJ1102遗传关系较远，毒株的变异仍然在持续发生，这可能提示以CV777和AJ1102为免疫原设计的传统疫苗对目前湖北地区的流行毒株的保护率下降，在预防PED方面可能作用不显著，无法提供全面的免疫保护，成为PEDV暴发的主要隐患[18-19]。
研究结果表明，2021-2022年间湖北地区猪群存在不同程度的PEDV感染，其抗原表位发生了较大的变异。这提示在生产管理中，加强生物安全管理水平，在冬季、雨季来临前需注意猪舍防寒保暖措施的准备及温湿度的控制；
加强饲养管理水平，提升猪群自身抵抗力，严格执行免疫接种程序，并关注生猪调运及引种带来的风险。PEDV的变异仍然在持续，目前广泛使用的疫苗存在与流行毒株不匹配的现象，使疫苗无法提供有效的保护。建议加强对PEDV的猪群动态监测及毒株变异规律的研究，及时掌握其变异特征，以此来筛选与猪场流行毒株基因型相匹配的疫苗，并指导PEDV疫苗的改进和研制。
