龙脑樟法呢基焦磷酸合酶基因克隆及表达模式分析

杨 琳，张杭颖，杨 帆，朱泽榕，李秋妹，张君诚*

龙脑樟法呢基焦磷酸合酶基因克隆及表达模式分析

杨 琳1，张杭颖1，杨 帆2，朱泽榕1，李秋妹1，张君诚1*

1. 三明学院药用植物开发利用福建省高校工程研究中心，福建三明 365004；
2. 福建农林大学食品科学学院，福建福州 350000

法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthetase，FPS）是萜类及其衍生物合成的关键限速酶。本研究以龙脑樟为材料，基于转录组测序，克隆基因，利用生物信息学软件分析该基因编码的氨基酸序列特征，并采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测基因的表达，分析龙脑樟根、茎、叶中该基因的表达与总萜含量的关系。结果表明：基因的开放阅读框为1053 bp，编码350个氨基酸，分子量为40.4 kDa，等电点pI为5.25，亲水性平均值（GRAVY）为-0.299。氨基酸同源性与沉水樟最高（98.86%），含有7个相同的保守结构域和2个富含天冬氨酸的基序[DDXX(XX)D]。二级结构α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的比例分别为61.14%、6.57%、2.86%和29.43%，三级结构预测与沉水樟极其相似。系统发育树（NJ树）结果显示，CcFPS蛋白与同为樟科的沉水樟、山苍子的FPS处于同一个分支上。基因在龙脑樟的根、茎、叶中均有表达，且表达具有组织特异性，在叶中的相对表达量最高，根中次之，茎中最低。在CcFPS蛋白调控的萜类物质代谢通路中，茎中的总萜含量最高，根中次之，叶中最低。龙脑樟基因表达与总萜含量具有相关性，为进一步解析基因在龙脑樟萜类化合物合成过程中的作用提供参考。

龙脑樟；
法呢基焦磷酸合酶（FPS）；
基因表达；
总萜

龙脑樟（）是鲜叶精油中富含右旋龙脑（天然冰片）、葎草烯、齐墩果酸、龙脑香醇酮等萜类及其衍生物的樟树，素有植物黄金的美誉[1]。其作为食品、医药、香料等重要原料，有止痛、抗菌、消炎等作用，常应用于治疗心血管疾病、冠心痛等[2]。近年来，已有研究表明，龙脑樟提取物在抗炎、抗氧化及抗癌方面也有十分显著的效果[3-4]。

龙脑樟的鲜叶精油主要含有萜类化合物（类异戊二烯）[5]。类异戊二烯是维持植物生长发育必需的有机物质，通过甲羟戊酸途径（mevalonic acid pathway，MVA pathway）及5-磷酸脱氧木酮糖/2C-甲基4-磷酸-4D-赤藓糖醇途径途径（1-dexoy-D-xylulose 5-phosphate/2C-methy 1-E- erythritol 4-phosphate pathway，DOXP/MEP pathway）途径合成[6-7]，均以异戊烯基焦磷酸为前体合成萜类化合物，如图1所示[8]。FPS是异戊烯基转移酶家族成员之一，是异戊烯基焦磷酸和二甲基烯内焦磷酸缩合反应的关键限速酶[9]，催化甾醇、法呢基化蛋白和多萜等异戊烯衍生物合成[10]。目前，已从拟南芥和金线莲等植物体中克隆基因，该基因在植物中表达具有组织特异性，同时还影响类异戊二烯衍生物的含量[11-12]。但在樟科植物中，仅香樟中克隆了基因，未见基因表达调控下游产物富集的报道[13]。本研究通过克隆基因，探究基因表达对龙脑樟萜类物质的合成代谢的影响，为龙脑樟天然资源的综合开发与利用提供理论基础。

1.1 材料

龙脑樟取自江西吉安移栽至福建三明，经三明学院张君诚教授鉴定。取移栽龙脑樟当年生、半木质化、无病虫害的枝条，剪成具有4～6个腋芽的茎段作为外植体，将其经过表面消毒后组织培养8个月。将龙脑樟组培苗移栽至花盆中（营养土∶蛭石为3∶1），放置在25℃（昼）/20℃（夜）、相对湿度60%～70%、光照300 μmol/(m2·s)（14 h）/黑暗（10 h）的光照培养室培养6个月。

图1 植物萜类化合物的生物合成途径

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA合成 取长势一致移栽6个月的龙脑樟苗木的根、茎、叶，液氮速冻并于–70℃保存，设置3个生物学重复。分别参照全能型植物RNA提取试剂盒（康为世纪，北京）和cDNA逆转录试剂盒（TaKaRa，大连）说明书提取获得龙脑樟根、茎、叶的cDNA备用。

1.2.2基因开放阅读框的克隆 基于龙脑樟RNA-seq结果，采用以Primer 5.0 设计基因开放阅读框引物5-ATGGCTGCGGCGCC AAATGG-3/5-CTACTTTTGCCTCTTGTAGATCTTGCCCAAG-3，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以龙脑樟根、茎、叶的cDNA混合液为模板，使用高保真酶Prime STAR HS DNA polymerase（TaKaRa，大连）扩增，扩增总体系为25 μL。反应程序为：94℃变性5 min；
94℃变性30 s，60.7℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增34个循环。扩增结束后，以1.5%琼脂糖凝胶，110 V电压，电泳30 min。采用Gel Extraction Kit（上海生工生物工程技术服务有限公司）回收目的基因的DNA片段，连接PMD19-T（TaKaRa，大连）载体，转化、涂板后挑取单克隆，菌液检测阳性后送上海美吉生物公司进行测序。

1.2.3 CcFPS蛋白的生物信息学分析 使用生物信息学软件分析CcFPS蛋白的理化特性（https:// web.expasy.org/protparam）、氨基酸疏水性（http:// web.expays.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）、蛋白质二级结构（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa.automat.pl?Page=npsa_sopma.html）、蛋白质三级结构（https://swissmo del.expasy.org/）等。下载已知植物的FPS氨基酸序列，使用DNAman构建CcFPS蛋白的系统发育树。

1.2.4基因的表达分析 分别取龙脑樟根、茎、叶的cDNA为模板，将龙脑樟根、茎、叶的cDNA样品稀释至浓度一致，每个样品3个技术重复。以持家基因作内参[14]，利用NCBI网站的Primer-BLAST设计和基因的实时荧光定量PCR（qPCR）引物（表1）。采用SYBR Green法通过qPCR检测基因在根、茎和叶中的表达量，反应体系为10 μL。反应程序：95℃预变性10 s；
95℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，延伸结束收集荧光，46个循环，之后从50℃开始，以每步0.5℃的速度升高至95℃，每个温度保持5 s。最后用2–△△CT法计算各样品中基因的相对表达量，并进行显著性分析。

表1 CcFPS基因的qPCR引物序列

1.2.5 龙脑樟总萜的提取 用无菌蒸馏水洗净移栽6个月长势一致的龙脑樟的根、茎、叶，烘干研磨成粉末状。将过60目筛精密称量2 g的龙脑樟根、茎、叶粉末放置于锥形瓶中。按液料比10∶1（mL/g）加入95%乙醇，在额定功率300 W的超声波清洗器中45℃水浴40 min。将超声处理后的粗提液至于大型离心管中，4℃ 8000 r/min离心10 min，准确吸取样品液50 μL，用95%乙醇定容于10 mL容量瓶中，得到龙脑樟不同组织器官萜类化合物提取液。

1.2.6 龙脑樟总萜的含量检测 用电子天平称取熊果酸标准品0.010 g，将其溶于95%乙醇中，并定容至10 mL容量瓶中，获得浓度为1.0 mg/mL的标准样品液。按照梯度稀释标准液，依次得到浓度为0.2、0.04、0.008、0.0016、0.000 32 mg/mL标准样品液。使用紫外分光光度计，在210 nm测定吸光值，绘制标准曲线[15-16]。取龙脑樟不同组织器官萜类化合物提取液，于210 nm处检测吸光值，计算样品总萜含量。

1.2.7 龙脑樟萜类化合物与基因相关性分析 使用SPSS v.18.0统计学分析软件对基因表达和萜类化合物含量进行相关性分析和差异显著性分析。

2.1 CcFPS基因的ORF序列

以龙脑樟的cDNA为模板进行PCR扩增，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，在1000～2000 bp之间有单一亮带。经测序，该扩增片段长1053 bp，编码350个氨基酸（图3）。

M: DL2000 DNA marker.

2.2 CcFPS蛋白的氨基酸序列特征

CcFPS蛋白的开放阅读框编码350个氨基酸，分子量为40.4 kDa，等电点pI为5.25，亲水性平均值（GRAVY）为–0.299。该氨基酸序列与沉水樟（，RWR95015.1）、山苍子（，ART33314.1）、腊梅（，ACJ38671.1），野大豆（，XP_0282 04967.1）和乐昌含笑（，ACS74708.1）的FPS氨基酸序列同源性均超过75%，与沉水樟的FPS蛋白具有很高的同源性（98.86%），含有7个相同的保守结构域和2个富含天冬氨酸的基序[DDXX(XX)D]（图3）。通过软件Signalp 4.1和TMHMM预测为非信号肽序列，亚细胞定位于细胞质。二级结构α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的比例分别为61.14%、6.57%、2.86%和29.43%。三级结构预测如图4所示。系统发育树（NJ树）分析结果显示，CcFPS蛋白与同为樟科的沉水樟、山苍子的FPS处于同一个分支上，其中与沉水樟的亲缘关系较近（图5）。

相似度用黑色（100%）、灰色（33.34%～83.34%）和白色（0%～33.33%）背景表示。线段表示FPS的保守结构域，编号从1到7。2个方框内为富含天冬氨酸的高度保守区。

2.3 CcFPS基因的表达特征

通过qPCR检测龙脑樟不同器官中基因的相对表达量，结果显示，基因在龙脑樟的根、茎、叶中均有表达，在叶中表达量最高，是根的1.69倍，是茎的2.56倍，二者差异均达极显著；
茎的表达量最低，仅是根的0.66倍，叶的0.39倍，二者差异显著（图6）。

图4 龙脑樟和沉水樟FPS蛋白三级结构预测图

2.4 总萜含量变化

以熊果酸为标准品，所得的回归方程为=0.0689+0.0638，2=0.9925，标准曲线的线性相关良好，相关系数大于0.99。测得龙脑樟根、茎和叶中的总萜含量如图7所示。根、茎、叶中均含有萜类物质，其中根和茎中的含量高于叶中的，分别为67.60 mg/g和70.23 mg/g，二者差异不显著；
叶中含量最低，仅为50.84 mg/g，与根差异显著，与茎差异极显著。

图5 龙脑樟与其他植物的FPS蛋白系统发育树

*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。

*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。

2.5 相关性分析

通过对龙脑樟不同器官中总萜含量与基因表达量进行相关性分析（图6和图7），结果表明，龙脑樟总萜含量与基因表达量呈负相关，其相关性为=0.979，=0.131。

不同的提取方式影响植物萜类化合物的含量。本研究采用超声波法提取龙脑樟中的总萜成分，其根、茎、叶中的含量分别为67.60、70.23、50.84 mg/g。已有研究人员比较了水蒸气蒸馏、同时蒸馏萃取、溶剂浸提、超声辅助提取、微波辅助提取和超声-微波协同萃取作为预处理方法提取艾纳香叶中左旋龙脑、异龙脑和樟脑等萜类化合物等的效率，不同预处理方法联合GC测定的精密度、重复性、稳定性均满足要求，回收率存在差异[17-18]。杨长水等[15]使用超声辅助法提取黄花三宝木中总萜成分，得率为1.27%。在检测龙脑樟中龙脑、乙酸龙脑酯、异龙脑等一种或几种萜类化合物含量时，多使用水蒸汽蒸馏法提取，气质联用技术分离和检测[19-20]。结果显示，龙脑樟鲜叶中提取纯化后的天然冰片中右旋龙脑质量分数均在98.45%以上，樟脑及乙酸龙脑酯的质量分数较低，不含异龙脑[19]。龙脑樟植物不同部位右旋龙脑的含量，结果显示阴干后叶较高为63.97%[20]。

本研究检测总萜含量在茎部最多，其次是根部，叶片中最少。龙脑樟萜类化合物种类在不同器官中不同，叶中的萜类化合物种类最丰富，有36种，根和茎中分别有26种和27种[21]。阴干后叶中右旋龙脑的含量（63.97%）较龙脑樟植物的鲜花、鲜枝、鲜皮、鲜叶、干枝、干叶、落叶等部位高[20]。总萜种类和部分萜类化合物含量差异还与植物自身所累积的次生代谢物的产物含量具有组织或器官特异性有关[22]，且伴随着植物生长发育其含量往往也会有所变化[22-23]。江西省不同产地的樟树根、茎、枝、果、叶中龙脑樟挥发油含量及物理性质方面存在显著差异[24-25]；
不同化学型、不同干燥方式均会影响龙脑樟不同组织器官挥发油的含量[25-28]。

qPCR结果显示，基因在叶中的表达量最高，茎中的表达量较低，叶与茎、叶与根的差异性均为极显著，根和茎的表达性为显著。基因在建泽泻（）、刺五加（）、金线莲（）的不同组织器官中也均有表达[12, 29-30]，叶中的表达量高于茎和根[29-30]。CUNILLERA等[31]分析了拟南芥的和基因，结果表明这2个基因在根、茎、叶、幼苗及花中均有表达，其中基因在根和花中表达量较高，而基因在根和花中表达量较低，在花序中优先累积。由此可知，基因为家族基因，不同的基因在组织器官的表达量具有组织表达特异性。基因的表达还会影响萜类化合物的合成[32-33]。研究表明，千里光（）中的基因在大肠杆菌中表达，可提高倍半萜含量[32]；
转基因珠子参（）细胞系中基因的相对表达量、FPS酶活及皂苷含量相比于野生型均有不同程度的提高[33]。然而，在植物体中，除了基因表达外，蛋白翻译、酶活力、下游物质代谢等因素都会影响萜类化合物的富集[34]。本研究结果表明，龙脑樟不同组织器官基因表达和萜类化合物含量为负相关，可能与龙脑樟萜类化合物次生代谢途径的多样性有关。DMPP与2个IPP分子头尾缩合生成牻牛儿基焦磷酸盐（GPP）后，FPS催化GPP生成法尼基焦磷酸盐（FPP）。FPP是倍半萜、三萜和甾体的生物合成前体，是植物中萜类生物合成的分支点酶，调节植物甾醇的生物合成[12]。萜类化合物代谢途径的复杂性也是影响不同器官FPS基因表达和总萜含量的重要因素。

基于转录组测序扩增的开放阅读框序列是基因序列。基因在龙脑樟的根、茎、叶中均有表达，且表达具有组织特异性；
基因表达与龙脑樟总萜含量呈负相关。该研究为进一步解析通过调控基因表达，提高龙脑樟右旋龙脑（天然冰片）、葎草烯、齐墩果酸、龙脑香醇酮等萜类化合物成分富集提供参考。

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Molecular Cloning and Expression of Farnesyl Pyrophosphate Synthetase in

YANG Lin1, ZHANG Hangying1, YANG Fan2, ZHU Zerong1, LI Qiumei1, ZHANG Juncheng1*

1. Fujian Provincial Medical Plant Exploitation and Utilization Engineering Research Center, Sanming University, Sanming, Fujian 365004, China; 2. School of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350000, China

Farnesyl pyrophosphate synthase (FPS) catalyzes the key step of isoprenoid biosynthesis. The expression level ofgene influences the composition and content of essential oil in. In this research, based on transcriptomic analysis, the open reading frame (ORF) sequence ofwas cloned from. The characteristics of amino acids of CcFPS protein was analyzed by bioinformatic softwares. The expression pattern ofand total terpene content were detected from leaf, root, and stem by quantitative real-time PCR and ultraviolet spectrophotometry, respectively. The results showed that the ORF ofwas 1053 bp in length, encoding 350 amino acids with molecular weight 40.4 kDa, isoelectric point pI 5.05, and grand average of hydropathicity (GRAVY) -0.299. The secondary structure contained 61.14% α-helice, 6.57% extended strand, 2.86% β-turn and 29.43% random coil. The three-dimensional structural was predicted to be similar with FPS of. The CcFPS protein possessed seven conserved domains and two aspartate-rich motifs [DDXX(XX)D] and showed the highest homology with FPS of(98.86%). Phylogenetic tree analysis showed that the CcFPS protein was clustered into the same group with the FPS proteins fromand. The expression ofshowed tissue specific expression, highest level in leaf and lowest level in stem, although it’s detectable in leaf, root and stem. The total terpenes content was the highest in stem, following in root and the lowest in leaf. The total terpene content was correlated with the expression of. The study would provide insights into understanding the role ofin the terpenoids metabolic in.

; farnesyl pyrophosphate synthetase (FPS); gene expression; total terpene

Q949.7

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.005

2021-12-16；

2022-03-14

福建省科技厅面上项目（No. 2020J01382）；
福建省教育厅中青年教师教育科研项目（No. JAT190703）。

杨 琳（1986—），女，博士，讲师，研究方向：植物分子生物学。*通信作者（Corresponding author）：张君诚（ZHANG Juncheng），E-mail：19900204@fjsmu.edu.cn。

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